Phổ khối lượng được ghi trên máy HP - 5989B - MS tại phòng phân tích cấu trúc (Viện hóa học). Vì điều kiện có hạn nên chúng tôi chỉ ghi được phổ khối lượng của chất đại diện (1, 2). Hai phổ đồ được trình bày ở các phụ lục
11-12. Kết quả ghi được ở bảng 2.5.
Kết quả phân tích cho thấy cả 2 chất (1, 2) đều có pic phân tử và có số khối đúng bằng số khối chất dự kiến. Ngoài ra, phổ khối lượng còn cho phép nhận biết các pic phân mảnh của 2 chất này phù hợp với các sơ đồ phân mảnh.
Kết quả phân tích phổ khối lượng đã góp phần chứng minh cấu tạo hai chất (1, 2) đúng như dự kiến.
Bảng 2.5: Sô liệu phổ khối lượng của hai chất 1,2
Chất Công thức cấu tạo m/z
o ---m y j O2K — CH = C 266 (M ^) 207 (M -H N C S ) 179 (207-C O ) 133 ( I7 9- N O2) 89 (133- C S ) 63 (89 - C2H2) O9N --- ^ N - C H 2- / H =c M = 363,37 363 (M ^) 266 M H C H2— N/■ V 207 (266-H N CS) 179 (207-C O ) 133 ( I7 9 -N O2) /■ 98 - C H2- N V 89 (133-C S ) 63 (89 - Q H ,)
o _ s ---N - C H r N ) m h 363 + IH 1 r + c hJ -n A V mJz 98 - C .H miz 56 3^6 CH2 CH2 + 0 2N^ m/z 266 -H N C S + + y j r ^ H = c = s O2N ml z 179 -N O ’: \ /; H=c=s + mJz 133 -C S m/z 89 -C2H2 9 ^ 4 m/z 63
2.4. THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC
Với mục đích là tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng trong sử dụng làm thuốc, chúng tôi tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được. Kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các dẫn chất rhodanin đã được công bố và trình bày ở phần tổng quan gợi ý cho chúng tôi định hướng thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư.
2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa Học), các chất do chúng tôi tổng hợp đã được thử nghiệm để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
* Nguyên tắc:
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chiết theo phương pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) theo 2 bước:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính.
Buớc 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính. * Chất thử: Các chất 1, 2, 3, 4, 5.
* Kháng sinh kiểm định: Ampixilin đối với vi khuẩn Gr(+), Tetracyclin đối vái vi khuẩn Gr(-), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men.
* Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
- VK Gr (-): Escherichia coỉi (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
- VK Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus
- Nấm sợi: Aspergillus niger
- Nấm men: Candida albicans
Saccharomyces cerevisiae
* Tiến hành:
- Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính.
+ Chuẩn bị vi nấm và vi khuẩn: Nấm và vi khuẩn được duy trì irong môi trường dinh dưỡng Sabouraud dextrose broth và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thực nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với vi nấm).
+ Chuẩn bị mẫu thử; Chất thử được hòa tan trong DMSO 100%.
+ Từ dung dịch gốc pha loãng thành 4 - 1 0 thang nồng độ rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
+ Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn dung dịch v s v đã hoạt hóa và đã được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5 đơn vị McLand (khoảng 10^ vsv/ml).
+ Đối chứng dương:
Dãy 1: Môi trường
Dãy 2: Kháng sinh (Ampicilin) + vi khuẩn Gr (+); Kháng sinh (Tetracyclin) + vi khuẩn Gr (-); Kháng sinh (Nystatin) + vi nấm.
+ Đối chứng âm: Qiỉ có vi nấm, vi khuẩn kiểm định tể trong tủ ấm 37®c/24h đối với vi khuẩn và 30^c/48h đối với vi nấm.
- Bước 2; Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính.
Các bước tiến hành như bước 1. Riêng các mẫu có hoạt tính ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần ( 5 - 1 0 thang nồng độ) để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi khuẩn, vi nấm bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
tính.
Chúng tôi thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của 5 chất (1, 2, 3, 4, 5) và kết quả được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Chất
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC): ịig/ml
Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men
E. coli p. aeruginosa B. subtillis s. aureus Asp. niger F. oxysporiim s. cerevisiae c. albicans 1 (-) (-) 50 50 (-) 25 (-) (-) 2 (-) (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) 3 (-) (-) (-) 50 (-) 50 (-) (-) 4 (-) (-) (-) 50 (-) 25 (-) (-) 5 (-) (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) * Nhận xét:
- Kết quả thử nghiệm cho thấy, 3 chất (1, 3, 4) có tác dụng kháng khuẩn vói mức độ khác nhau trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định, chất (2, 5) không có tác dụng kháng khuẩn đối với 4 chủng vi khuẩn kiểm định.
- So sánh tác dụng kháng khuẩn của 5 chất đem thử cho thấy:
+ Cả 5 chất đều không có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Gr (-). + Chất (1) có tác dụng kháng khuẩn với 2 chủng vi khuẩn kiểm định là
Bacillus subtillis và Staphylococcus aureus với MIC = 50 ịig/ml.
+ Chất (3, 4) có tác dụng kháng khuẩn vói 1 chủng vi khuẩn kiểm định là
Staphylococcus aureus.
- Cả năm chất đều có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với chủng vi nấm kiểm định Fusarium oxysporum, cả năm chất đều không có hoạt tính kháng nấm đối với ba chủng vi nấm kiểm định còn lại.
- Như vậy kết quả thử nghiệm cho thấy chất (1) có phổ kháng 3 trên 8 chủng vi sinh vật kiểm định, chất (3, 4) có phổ kháng 2 trên 8 chủng vi sinh vật kiểm định, chất (2, 5) có phổ kháng 1 trên 8 chủng vi sinh vật kiểm định.
2.4.2. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người.
Do điều kiện hạn chế, chúng tôi chỉ tiến hành thử tác dụng kháng tế bào ung thư người của 2 chất (1, 2) để thăm dò hoạt tính kháng ung thư của chất này.
* Nguyên tắc:
Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người được tiến hành theo phưoíng pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
* Dòng tê bào thử nghiệm:
- Hep - 2 ; Tế bào ung thư gan người. - LU : Tế bào ung thư phổi.
* Tiến hành:
- Tế bào ung thư được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log sẽ được sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẩn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lượng 96 giếng.
- Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử, được ủ trong tủ ấm CO2/ 37^c để tế bào tiếp tục phát triển.
- Sau 48h - 72h lấy ra, cố định tế bào. rửa, nhuộm và hòa lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy đọc Elisa bước sóng 495 - 515 nm.
- Giá trị IC50 được tính trên chương trình Table curve với giá trị logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị ED đo được.
- Các mẫu thô có IC50 < 2 0 ịig/ml, chất tinh khiết có giá trị IC50 < 5 ụg/ml là có hoạt tính.
- Lưu ý: Song song làm phiến đối chứng OD (ngày Ü) để đối chứng cho lượng tế bào khi kết thúc thí nghiệm. Cách cố định và nhuộm như với các mẫu thử.
- Dựa vào kết quả đo được của mẫu chứng OD (ngày 0) và OD của DMSO 10% so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu thử để tìm giá trị ED50 theo công thức:
OD (mẫu) - OD (ngày 0)
ED = r ~ ______ 100%
OD (DMSO 10%) - OD (ngày 0)
Mẫu có giá trị ED < 50% là mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED50 của 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table cuver theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
Ln = a + bX
Y : nồng độ chất thử X; giá trị ED50
Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư gan Hep-2 và dòng tế bào ung thư phổi (Lư) của hai chất (1, 2). Kết quả trình bày ở bảng 2.7.
Bảng 2.7: Kết quả thử hoạt tính kháng tê bào ung thư ngưòi
Chất
Dòng tế bào Hep - 2 Dòng tế bào LU
Kết luận Giá trị IC50 (ụg/ml) Tỷ lệ tế bào sống sót (%) Giá trị IC50 (pg/ml) Tỷ lệ tế bào sống sót (%) DMSO 1 0 0,0± 0 ,0 1 0 0,0± 0 ,0 Chứng (+) 0,3 2 ,0 ±0 ,0 0,33 3,3 ±0,02 Dương tính 1 1,188 2,87 ±0,1 2,722 30,6 ± 0,3 Dương tính 2 dòng 2 3,712 35,6 ± 0,5 >5 63,8 ± 1,86 Dưoỉng tính 1 dòng Ghi chú: Chứng (+): Ellipticin * Kết quả:
Trong hai chất đem thử tác dụng kháng tế bào ung thư người, chất (1) có hoạt tính kháng cả hai dòng tế bào ung thư Hep-2 và LU. Chất (2) có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Hep-2 nhưng không có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư LU.
2.5. BÀN LUẬN
2.5.1. Về tổng hợp hóa học
- Phản ứng ngưng tụ 3-nitrobenzaldehyd với rhodanin để tổng hợp chất
(1) được thực hiện trong dung môi acid acetic băng và xúc tác natri acetat khan đã thu được kết quả như một số công trình đã công bố [15].
- Trong quá trình thực hiện phản ứng Mannich để tổng hợp các dẫn chất base Mannich của chất (1), chúng tôi đã xác định nhiệt độ phản ứng thích hợp để tổng hợp các chất là 70°c. ở nhiệt độ này, hỗn hợp tan hoàn toàn và có thể theo dõi quá trình phản ứng bằng SKLM.
- về thời gian phản ứng Mannich, kết quả thực nghiệm cho thấy, đối với phản ứng có sự tham gia của các hợp phần amin bậc 2 có lực base mạnh (piperidin, morpholin) (các chất 2, 5) thì thời gian phản ứng ngắn hơn so với các phản ứng vói sự tham gia của các amin thơm bậc 1 lực base yếu (anilin, p - toluidin) (chất 3, 4) (2 giờ so với 3 giờ). Điều này phù hợp với cơ chế của phản ứng Mannich.
2.5.2. Về xác định cấu trúc
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ khối lượng cho phép chúng tôi kết luận cấu trúc của các chất tổng hợp được đúng như dự kiến.
Tuy nhiên, chúng tôi hiểu rằng để xác định cấu trúc một cách đầy đủ hơn cần tiến hành phân tích phổ cộng hưồng từ proton (‘H - NMR) và phổ cộng hưởng t ừ ‘^CC^C -NMR).
2.5.3. Vê hoạt tính sinh học
- Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn cho thấy chất (1) có hoạt tính kháng khuẩn với 2 trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định. Trong khi đó 4 dẫn chất Mannich của nó có tác dụng kém hcfn: chất (2, 5) không có tác dụng với 4 chủng vi khuẩn kiểm định, hai chất (3, 4) có tác dụng với 1 chủng vi khuẩn kiểm định). Điều này chứng tỏ việc gắn nhóm base Mannich vào chất (1) đã không mang lại hiệu quả tác dụng kháng khuẩn, có lẽ do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của toàn phân tử làm giảm khả năng thấm qua màng tế bào vi khuẩn.
- Kết quả thử tác dụng kháng nấm cho thấy chất (1) và bốn dẫn chất base Mannich (chất 2- 5) đã thể hiện hoạt tính kháng nấm khá mạnh trên chủng vi
nấm Fusarium oxysporum, và đều không có tác dụng trên các chủng vi nấm
kiểm định còn lại. Có thể nhận thấy 3 chất (2, 3, 5) có hoạt tính kháng chủng nấm mốc Fusarium oxysporum kém hơn chất (1), chất (4) có tác dụng gần tương đương chất (1). Như vậy có thể thấy yếu tố cấu trúc chung có tác dụng
kháng nấm của dãy chất là khung phân tử 5-nitrobenzylidenrhodanin. Hoạt tính kháng nấm của dãy chất này và các dẫn chất của rhodanin khác cần được quan tâm nghiên cứu sâu thêm.
- Kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy 5-benzylidenrhodanin và các dẫn chất base Mannich đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm trên cả 8 chủng vi sinh vật kiểm định [7]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi nêu trên cho thấy 5-nitrobenzylidenrhodanin và các dẫn chất base Mannich tương ứng có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm kém hơn rõ rệt. Điều đó cho thấy nhóm thế - NO2 có thể làm giảm hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm do cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của phân tử thay đổi, và giảm khả năng thấm qua màng tế bào vi sinh vật.
- Về hoạt tính chống ung thư: Chất (1) có hoạt tính kháng cả hai dòng tế bào ung thư Hep-2 và LU, chất (2) có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Hep-2 nhưng không có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Lư. Tuy nhiên một chất tương tự là 5- benzyliden Vhodanin đã được công bố là không có hoạt tính chống tế bào ung thư [15]. Như vậy nhóm thế - NO2 có thể góp phần làm tăng hoạt tính chống tế bào ung thư của dẫn chất arylidenrhodanin. Chúng tôi cho rằng các dẫn chất 5- nitrobenzylidenrhodanin có triển vọng và cần được nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính chống tế bào ung thư.
Phần 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 3.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây chúng tôi rút ra một số những kết luận sau:
1. Đã tổng hợp được 5'(m-nitrobenzyliden)rhodanin và 4 dẫn chất base Mannich (2 - 5); trong đó 4 dẫn chất (2 - 5) chưa thấy công bố trong tài liệu tham khảo được.
2. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Xác định cấu trúc bằng phân tích quang phổ hồng ngoại, quang phổ tử ngoại và phổ khối lượng. Kết quả cho phép chúng tôi sơ bộ kết luận: các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến.
3. Đã thử tác dụng kháng khuẩn của 5 chất và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 5 chất (1, 2, 3, 4, 5) với 4 chủng vi khuẩn kiểm định
{Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtillis,
Staphyỉococcus aureus). Kết quả cho thấy chất (1) có tác dụng kháng 2 trên 4
chủng vi khuẩn kiểm định, chất (3, 4) có tác dụng kháng 1 trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định, chất (2, 5) không có tác dụng kháng khuẩn trên 4 chủng vi khuẩn kiểm định.
4. Đã thử tác dụng kháng nấm và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 5 chất (1, 2, 3, 4, 5) với 4 chủng vi nấm kiểm định gồm:
Aspergillus niger; Saccharomyces cerevisiae; Candida albicans; Fusarium
oxysporum. Kết quả cả năm chất đều có hoạt tính kháng nấm mạnh đối với
chủng vi nấm kiểm định Fusarium oxysporum với MIC = 25 - 50 Ịig/ml, cả năm chất đều không có hoạt tính kháng nấm đối với ba chủng vi nấm kiểm đinh còn lai.
5. Đã thử tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư người (Hep-2, LU) của 2 chất (1, 2). Kết quả cho thấy chất (1) có hoạt tính kháng cả hai dòng tế bào ung thư Hep-2 và LU. Chất (2) có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư Hep-2 nhưng không có hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư LU.
Với các kết quả đã đạt được, chúng tôi hy vọng đề tài này sẽ đóng góp một phần nhỏ vào việc nghiên cứu các dẫn chất của rhodanÌR.
3.2. ĐỂ XUẤT
Để tiếp tục phát triển các kết quả đã đạt được, chúng tôi có những đề xuất sau:
- Cần tiếp tục thử hoạt tính chống ung thư của 3 chất (3, 4,5) đã tổng hợp được và nghiên cứu độc tính của các chất có tác dụng (chất 1, 2) để hướng tới ứng dụng trong điều trị.
- Tiếp tục tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học của các đẫn chất rhodanin nhằm tìm kiếm các chất có triển vọng trong dãy chất này.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT:
1. Bộ môn hóa hữu cơ - Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Hóa hữii cư tập, Tập I.
2. Bộ môn hóa hữu cơ - Trường đại học Dược Hà Nội (2004), Hóa hữii cơ tập, Tập II.
3. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam III, Nhà xuất bản Y học, PL. 10. 4. Bộ môn hóa phân tích - Trường đại đọc Dược Hà Nội (2003), kiểm