L ỜI CẢ M ƠN
3.2. Thử nghiệm sinh sản nhân tạo cầu gai Tripneustes gratila
Quá trình phát triển phôi ở cầu gai được trình bày qua bảng 3.2
Bảng 3.2. Quá trình phát triển phôi của cầu gai Tripneustes gratila
TT Thời gian sau thụ
tinh
Giai đoạn phát triển
Đặc điểm
1 3 phút Trứng thụ tinh - Trứng xuất hiện màng trương nước - Tỉ lệ thụ tinh: 84,8%
2 60 phút Giai đoạn 2 tế
bào
- Phôi bào phân cắt hoàn toàn đều tạo thành 2 tế bào bằng nhau
3 2 giờ 30 phút Giai đoạn 4 tế
bào
- Phôi bào phân cắt thành 4 tế bào bằng nhau
4 3 giờ 45 phút Giai đoạn 8 tế
bào
- Phôi bào phân chia thành 8 tế bào bằng nhau
5 4 giờ 30 phút Giai đoạn 16 tế
bào
- Phôi bào phân chia thành 8 tế bào bằng nhau ở cực động vật và cực thực vật phân chia thành 4 tế bào lớn và 4 tế
bào nhỏ
6 5 giờ 20 phút Giai đoạn 32 tế
bào
- Phân cắt đều theo chiều ngang tạo thành 2 lớp tế bào
7 7 giờ Giai đoạn 64 tế
bào
- Phân cắt tạo thành một phôi bào với 8 tầng hoặc lớp tế bào
8 9 giờ 23 phút Giai đoạn phôi nang
(blastrula)
- Phôi bào bắt đầu lõm vào, vách tế
bào mỏng dần, phân chia giảm, phôi di chuyển trong màng thụ tinh bằng tiêm mao 9 39 giờ 56 phút Giai đoạn phôi vị (gastrula) - Các tế bào bắt đầu đầy lên và sắp xếp thành 3 lớp: ngoại bì, trung bì và nội bì 10 49 giờ 30 phút Giai đoạn Prism - Phôi có dạng hình tròn kim tự tháp cắt ngắn. 11 65 giờ 40 phút Giai đoạn tiền ấu trùng - Ấu trùng hình trụ dài, có thể phân biệt được hậu môn - Tỉlệnở: 80,7%
Trứng đã thụ tinh là trứng hình thành lớp màng trương nước bao quanh trứng, trong thí nghiệm này sau 3 phút kể từ lúc thụ tinh có thể quan sát được màng này dưới kính hiển vi, độ phóng đại 400 lần (hình 3.7.1). Tỉ lệ thụ tinh ở cầu gai Tripneustes gratilla là 84,8%. Sự hình thành màng trương nước được ghi nhận là dễ dàng quan sát
ở những loài cầu gai khác thuộc giống Lytechinus và Stronglyocentrotus [25].
Sau khi thụ tinh 60 - 90 phút trứng bước vào giai đoạn 2 tế bào, trong giai đoạn này tế bào phân chia thành hai tế bào bằng nhau, mặt phằng phân chia là kinh tuyến hoặc đi dọc theo chiều dọc của cực thực vật và động vật (Hình 3.7.2).
Sau 2 giờđến 2 giờ 30 phút trứng bước vào giai đoạn phân chia 4 tế bào.
Ở giai đoạn này, phôi bào vẫn phân cắt thành 4 tế bào bằng nhau (Hình 3.7.3)
Từ 3 đến 4 giờ sau khi thụ tinh trứng bước vào giai đoạn phân chia thành 8 tế bào, khác với giai đoạn 2 và 4 tế bào, ở giai đoạn này trứng phân cắt ngang theo xích đạo và hình thành nên 8 tế bào có kích thước bằng nhau. Tuy nhiên, có một khoang nhỏ
giữa các phôi bào, trong các giai đoạn phân chia tiếp theo khoang này sẽ mở rộng ra tạo để tạo thành blastocoel (khoang túi phôi chứa các phôi bào) (Hình 3.7.4).
Giai đoạn tiếp theo, 4 tế bào ở cực động vật phân chia bằng nhau, 4 tế bào tại cực thực vật phân chia không đều nhau, hình thành lên 16 tế bào, giai đoạn này vẫn còn khá dễ dàng cho việc quan sát dưới kính hiển vi (Hình 3.7.5). Giai đoạn này phôi bào
đã bắt đầu phân hóa và là mầm của các phần khác nhau của cơ thể sau này, 8 phôi bào (mesomeres) ở cực động vật là mầm của lá phôi ngoài, 4 phôi bào lớn (macromeres) ở
cực thực vật là mầm của lá phôi trong và lá phôi giữa, còn lại 4 phôi bào nhỏ
(micromeres) là cho nhu mô của ấu trùng [1].
Sau 5 – 6 giờ, phôi bước vào giai đoạn 32 phôi bào (Hình 3.7.6), đây là lần phân cắt thứ 5, ở lần phân chia này, các mesomeres phân cắt đều theo chiều ngang tạo thành hai lớp tế bào được đặt tên: an1 ở cực động vật và an2 bên dưới, macromeres và
1. Trứng đã thụ tinh 2. Giai đoạn hai tế bào [63]
3. Giai đoạn 4 tế bào 4. Giai đoạn 8 tế bào
7. Giai đoạn 64 tế bào 8. Giai đoạn blastrula
9. Giai đoạn đầu gastrula 10. Giai đoạn gastrula
11. Giai đoạn Prism 12. Giai đoạn tiền ấu trùng
Tại phân chia thứ sáu, tất cả các tế bào chia theo xích đạo để sản xuất một phôi bào 64 tế bào (hình 3.7.7) với tám tầng hoặc lớp tế bào [56]. Các an1 và an2, phân chia theo chiều ngang. Các macromeres phân chia theo chiều ngang, sản xuất hai tầng của các tế bào được gọi là veg1, và veg2. Các micromeres cũng phân chia theo chiều ngang. Do đó, giai đoạn 64 tế bào phôi từ cực động vật sang cực thực vật như sau: 16 an1, (hai lớp mỗi lớp 8 tế bào), 16 AN2 (hai lớp mỗi lớp 8 tế bào), 8 veg1, 8 veg2, và 16 micromeres (hai lớp mỗi lớp 8 tế bào). Các lớp này là rất khó khăn để phân biệt [25]. Trong thí nghiệm này, 9 - 10 giờ sau khi thụ tinh bắt đầu quan sát được phôi nang. Giai đoạn phôi nang (blastrula) đặc trưng bởi sự hình thành lớp tế bào bao quanh một xoang phôi (blastocoel) bên trong, tốc độ phân chia các tế bào giảm. Lớp lông mao bên ngoài phát triển cho phép phôi chuyển động trong màng thụ tinh (hình 3.7.8). Các tế bào của blastula được sắp xếp trong một lớp duy nhất xung quanh blastocoels [20]. Sự thẩm thấu của nước vào blastocoel tạo thành một lớp trong pha lê [21] [28]. Mười đến mười hai giờ sau khi thụ tinh, Blastrula sản xuất một enzyme gọi là “hatching enzyme” làm tan màng tế bào và trở thành một phôi bơi tự do [25]. Các tế
bào phát triển và bắt đầu sản xuất phiến cơ bản dọc theo blastocoels [47].
Giai đoạn phôi vị diễn ra sau 39 – 40 giờ kể từ khi thụ tinh, là giai đoạn có nhiều thay đổi lớn, và quan trọng nhất trong quá trình phát triển phôi (Hình 3.7.9,10), mà theo Lewis Wolpert “thời gian quan trọng nhất trong cuộc sống không phải là sinh ra, kết đôi hay chết đi mà là giai đoạn gastrulation”. Trong gastrulation, phôi thai bắt đầu hình thành. Nếu không có quá trình này, nhiều sinh vật sẽ chỉ là vòng tròn nhỏ mà không bao giờ có thể phát triển thành bất cứ thứ gì. Quá trình phát triển phôi ở cầu gai
được sử dụng trong việc tìm hiểu cơ chế của giai đoạn gastrulation [42]. Trong giai
đoạn này, các tế bào được xắp xếp lại, thành ba lớp: ngoại bì, trung bì và nội bì. Các thay đổi trong giai đoạn gastrulation trong phôi thai nhím biển đã được nghiên cứu rộng rãi bởi [56].
Giai đoạn Prism được đặc trưng bởi một sự thay đổi trong hình dạng tổng thể của phôi thai và bắt đầu của sự khác biệt của cấu trúc ấu trùng (Hình 3.7.11). Trong giai
đoạn này phôi có dạng hình tròn, kim tự tháp cắt ngắn. Phía bên của phôi thai có chứa các stomodaeum trở nên phẳng tạo thành bề mặt răng miệng của ấu trùng. Phía blastoporal của phôi thai cũng bị san phẳng và tạo thành bề mặt hậu môn của ấu trùng.
Sau khi thụ tinh 65 giờ, xuất hiện giai đoạn tiền ấu trùng, giai đoạn này ấu trùng có hình trụ dài, có thể phân biệt được hậu môn (Hình 3.7.12). Các ấu trùng phát triển
đầy đủ (pluteus) có phần cơ thể kéo dài, thùy miệng xuất hiện trên bề mặt răng miệng trên stomodaeum. Hai cánh tay đầu tiên phát triển từ thùy miệng, hai cánh tay tiếp theo xuất hiện trên ranh giới giao nhau giữa bề mặt bằng miệng và hậu môn. Dạ dày to ra và lấp đầy một phần lớn cơ thể của pluteus. Một ấu trùng pluteus ở giai đoạn phát triển được gọi là ấu trùng pluteus bốn tay [25]. Trong thí nghiệm này, chỉ tiến hành quan sát đến giai đoạn tiền ấu trùng.
KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
Kết luận
& Đặc điểm sinh lý sinh sản của cầu gai
Đặc tính lý học của tinh trùng
Cá thể đực thu được có đường kính dao động từ 7,9±0,3cm đến 8,5±1,1cm. Màu sắc tinh dịch cá thu được chủ yếu là màu vàng nhạt, mật độ của tinh trùng dao động từ 8,67±4,5×1010 tế bào/ml đến 12,4±1,28 ×1010 tế bào/ml.
Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên hoạt lực tinh trùng
Tỉ lệ pha loãng tốt nhất cho tinh trùng cầu gai là 1:50, vận tốc của tinh trùng sau khi pha loãng 3s là 126,33±0,67µm/s và phần trăm hoạt lực là 95,67±0,67%. Ở tỉ lệ
này thời gian vận động của tinh trùng đạt 1240±100 s.
Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu lên hoạt lực tinh trùng
Áp suất thẩm thấu phù hợp nhất cho tinh trùng cầu gai là 500 mOsm/kg, tinh trùng có hoạt lực với vận tốc đạt 94,33±2,72µm/s và phần trăm tinh trùng hoạt lực đạt 20±1,15% với thời gian hoạt lực là 2540±177,76s.
Ảnh hưởng của nồng độ ion (K+, Ca2+, Mg2+, Na+) lên hoạt lực tinh trùng
Ion K+ 0,4M, là tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng, với phần trăm tinh trùng hoạt lực là 38,67±1,33% và vận tốc của tinh trùng ghi nhận được là 79,67±3,84µm/s, tinh trùng hoạt lực trong khoảng thời gian 1200±36,64s
Ion Ca2+ 0,8M là tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng câu gai với 23,33±1,67% tinh trùng có khả năng hoạt lực, thời gian hoạt lực ghi nhận được là 360±34,64s, và vận tốc của tinh trùng là 37,67±1,76µm/s.
Ion Mg2+ 0,2M là tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng cầu gai, với phần trăm tinh trùng hoạt lực là 13±2,08%, vận tốc đạt 67,67±5,17µm/s, thời gian hoạt lực của tinh trùng đạt 2720±121,66s.
Ion Na+ 0,2M là tốt nhất cho hoạt lực tinh trùng, với vận tốc đạt 106±2,64µm/s và phần trăm tinh trùng hoạt lực đạt 80±2,89%, thời gian hoạt lực của tinh trùng là 1560±192,9s.
Thử nghiệm sinh sản nhân tạo cầu gai
Quan sát 100 trứng, sau khi thụ tinh 3 phút, tỉ lệ thụ tinh đạt 84,8%. Quá trình phát triển phôi trải qua 11 giai đoạn và sau 65 giờ phôi phát triển thành giai đoạn tiền
ấu trùng, tỉ lệ nởđạt 80,7%.
& Khuyến nghị
Đặc điểm sinh lý sinh sản cầu gai
Nghiên cứu đã tìm ra các yếu tố tác động lên hoạt lực của tinh trùng, tuy nhiên các nồng độ về ion Ca2+, K+, Mg2+ và áp suất thẩm thấu vẫn chưa phải là tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng cầu gai.
Cần tiến hành các nghiên cứu về sinh lý, sinh hóa của huyết tương tinh trùng cầu gai để tìm ra môi trường tối ưu cho hoạt lực của tinh trùng.
Cần bố trí thêm các thí nghiệm vềảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên hoạt lực tinh trùng.
Cần tiến hành các nghiên cứu về sinh lý sinh hóa tế bào trứng để hoàn thiện nghiên cứu về sinh lý sinh sản ở cầu gai.
Thử nghiệm sinh sản nhân tạo cầu gai.
Nghiên cứu đã thành công trong việc thử nghiệm sinh sản cầu gai trong phòng thí nghiệm, cần mở rộng quy mô của nghiên cứu để có thểđưa vào ứng dụng.
Cần đánh giá các tác động của pH, nhiệt độ lên quá trình tinh và phát triển phôi của ấu trùng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trần Thái Bái, (2007), "Động vật học không xương sống", Nxb Giáo dục. 2. Hồ Thu Cúc, (1996), " Tổ chức học - phôi sinh học ", Trường đại học Nha
Trang.
3. Phạm Thị Dự, (1994), Sơ bộ nghiên cứu sự phát triển của tuyến sinh dục nhum sọ (Tripneustes gratila) ở Vịnh Nha Trang, Viện Hải Dương học Nha.
4. Lưu Thị Dung và Phạm Quốc Hùng (2005), Môi phôi học thủy sản, Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh.
5. Đào Tấn Hổ (1994), "Danh mục động vật da gai".
6. Nguyễn Hữu Khánh, (2009), Nghiên cứu các đặc trưng sinh học của lớp sao biển và cầu gai trong các rạn san hô ở Vịnh Vân Phong - Bến Gỏi, tỉnh Khánh Hòa, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Nha Trang.
7. Phan Thị Thảo, (2005), Nghiên cứu bảo quản tinh trùng cá chép (Cyprinus carpio) trong nitơ lỏng tại trung tâm quốc gia giống thủy sản nước ngọt miền Bắc, Gia Lộc - Hải Dương, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Nha Trang. 8. Dương Tuấn, (1981), Sinh lý học động vật và cá, Trường đại học Nha Trang. 9. Võ Sĩ Tuấn, Nguyễn Huy Yết và Nguyễn Văn Long (2005), Hệ sinh thái rạn
san hô biển Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật.
Tài liệu tiếng Anh
10. Alavi, S.M. and Cosson, J. (2006), " Sperm motility in fishes. (II) Effects of ions and osmolality: A review", Cell Biol Int. 30.
11. Ana-Cristina, E. S. Vilela, Noritaka, Hirohashi. and Paulo, A.S. Mourão. (2008), " The structure of sulfated polysaccharides ensures a carbohydrate- based mechanism for species recognition during sea urchin fertilization", Biol. 52, pp. 551-559.
12. Andrew, N.L., Agatsuma, Y., Ballesteros, E., Bazhin, A.G., Creaser, E.P., Barnes, D.K.A., Botsford, L.W., Bradbury, A., Campbell, A., Dixon, J.D., Einarsson, S., Gerring, P.K., Hebert, K., Hunter, M., Hur, S.B., Johnson, C.R., Juinio-Menez, M.A., Kalvass, P., Miller, R.J., Moreno, C.A., Palleiro, J.S., Rivas, D., Robinson, S.M.L., Schroeter, S.C., Steneck, R.S., Vadas, R.L., Woodby, D.A. and Xiaoqi, Z. (2002), "Status and management of world sea urchin fisheries", Oceanography and Marine Biology. 40, pp. 343-425.
13. Barbara, H. Gibbons. and Gibbons, I.R. (1980), "Calcium induced quiescencein reactivated sea urchin sperm", J. Cell Biology. 84, pp. 13-27.
14. Benjamin, Mos, Kenneth, L. Cowden and Symon, A. Dworjanyn (2012), Potential for the commercial culture of the tropical sea urchin Tripneustes
gratilla in Australia,, Editors, RIRDC Publication, Australian Government: Rural Industries Research and Development Coporation.
15. Brain, Dale. (1985), "Sperm receptivity in sea urchin oocyties and eggs", J. exp. Biol. 118, pp. 85-97.
16. Cabrita, E., Robles, V. and Herráez, P. (2009), " Sperm quality assessment", in Elsa, Cabrita., Vanesa, Robles. , and Paz, Herráez., Editors, Methods in Reproductive Aquaculture Marine and Freshwater Species, CRC Press Taylor & Francis Group, pp. 93-149.
17. Carolina, A. Freire., Ivonete, A. Santos. and Denilton, Vidolin. (2011), "Osmolality and ions of the perivisceral coelomic fluid of the intertidal sea urchin Echinometra lucunter (Echinodermata: Echinoidea) upon salinity and ionic challenges", Zoologia. 28 (4), pp. 479-487.
18. Christen, R., Schackmann, R.W. and Shapiro, B.M. (1986), "Ionic regulation of sea urchin sperm motility, metabolism and fertilizing capacity", J Physiol. 379, pp. 347-365.
19. Cosson, J., Groison, L.A., Suquet, M., Fauvel, C., Dreanno, C. and Billard, R. (2008), "Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers", Reproduction September 1. 136, pp. 277-294.
20. Dan, K, Tanaka, S., Yamazaki, K. and Kato, Y. (1980), "Cell cycle study up to the time of hatching of the embryos of the sea urchin , Hemiceillrotus pulcherrimus", Devel. Growth and Diff. 22, pp. 589-598.
21. Dan, K. (1960), "Cylo-e mbryology of echinoderms and amphibia", Int. R ev. Cytol. 9, pp. 321-367.
22. Davidson, E. (1988), Gene Activity in Early Development, ed. 3rd, Academic Press, New York.
23. Davidson, E.H. (1989), "Lineage-specific gene expression and the regulative capacities of the sea urchin embryo: a proposed mechanism", Developmental Biology. 105, pp. 421-445.
24. Davidson, E.H. (1990), "How embryos work: a comparative view of diverse modes of cell fate specification", Developmental Biology. 108, pp. 365-389. 25. Don, Igelsrud., Carolyn, M. Conway and Conway., Arthur F. (2012), Sea
Urchin Development accessed, from
http://www.ableweb.org/proceedings/index.php.
26. Dworjanyn, S.A., Pirozzi, I. and Liu, W.S. (2007), "The effect of the addition of algae feeding stimulants to ar tificial diets for the sea urchin Tripneustes gratilla", Aquaculture International. 273, pp. 624-633.
27. Ferdi, A. van DORSTEN., Markus, WYSS., Theo, WALLIMANN. and Klaas, NICOLAY. (1997), "Activation of sea-urchin sperm motility is accompanied by an increase in the creatine kinase exchange flux", Biochem. J. 325, p. 411±416. 28. Gustafson, T. and Wolpert, L. (1962), "Cellular mechanisms in the formation
of the sea urchin larva. Change in shape of cell sheets ", Exp. Cell Res. 27, pp. 260--279.
29. Harvey, E.B. (1956), The American Arbacia and Other Sea Urchins, Princeton University Press, Princeton.
30. Havenhand., Jon N., Fenina-Raphaela, Buttler., Thorndyke, Michael C. and Williamson., Jane E. (2008), "Near-future levels of ocean acidification reduce fertilization success in a sea urchin", Current Biology. 18(15), pp. R651-R652. 31. Hbrstadius, S. (1939), The mechanics of sea urchin development, studied by
operative methods, Bio. Rev. Cambridge Phil. Soc, Editor^Editors, pp. 132- 179.
32. Hbrstadius, S. (1973), Experimental Embryology of Echinoderms., Clarendon Press, Oxford.
33. Hinegardner, R. (1975a), In The Sea Urchin Embryo, Springer Verlag, Berlin. 34. Hinegardner, R. (1967), "Echinoderms", in Wilt, F.H. and Wessels, N . K.,
Editors, Methods in Developmental Biology, Thomas Y. Crowell, New York, pp. 130--155.
35. Juinio - Menez, M.A., Bangi, H.G.P. and Malay, M.C.D. (2008), "Effect of type of feed, stocking density and grow-out site on gonad index, growth and