H Ọ V ỊC TRÍC TỰC VẬT ĐỐI VỚ
2.1.4. Thiết bị thí nghiệm
Tủ úm, tủ thanh trùng ƣớt, tủ thanh trùng khô, kính hiển vi, máy đo pH, lam đếm, cân điện tử, microwave, tủ cấy, kính hiển vi…
2.1.5. ông thức môi trƣờng đƣ c dùng trong bố trí thí nghiệm:
Môi trƣờng Potato Dextrose Agar (Shurtleff và Averre, 1999; trích dẫn Nguyễn Thanh Nam, 2012)
Khoai tây: 200 gram Đƣờng Dextrose: 20 gram Agar: 20 gram Nƣớc cất: 1000 ml pH: 6.5 – 6.8
23
2.2. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
2.2.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát hiệu quả của các loại thuốc h a học đối với
nấmTrichoconis sp.và Aspergillus sp. gây lem l p hạt l a in vitro.
M c đích: Đánh giá hiệu quả của các loại thuốc hóa học đối với nấm
Trichoconis sp. và Aspergillus sp. gây lem lép hạt lúa.
Thực hiện thí nghiệm:
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 13 nghiệm thức (12 nghiệm thức sử dụng thuốc hóa học và 1 nghiệm thức đối chứng), 5 lần lặp lại. Loại thuốc và nồng độ thuốc đƣợc trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trƣờng PDA không chứa thuốc hóa học.
- Chuẩn bị nguồn nấm Trichoconis sp. và Aspergillus sp.: nấm đƣợc nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10 ngày trƣớc khi tiến hành thí nghiệm. Khuẩn ty nấm sẽ đƣợc đục thành các khoanh có đƣờng kính 5mm khi thực hiện thí nghiệm.
- Các loại thuốc hóa học đƣợc tính toán liều lƣợng sao cho khi hòa tan vào chai thủy tinh chứa 100ml môi trƣờng PDA sẽ đạt đƣợc nồng độ đã định sẵn. Nấu tan môi trƣờng PDA. Khi chai môi trƣờng đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm đƣợc chai môi trƣờng bằng tay) thì đƣa lƣợng thuốc hóa học đã chuẩn bị vào chai, lắc chai môi trƣờng để thuốc hòa tan đều vào môi trƣờng. Sau đó, môi trƣờng trong chai sẽ đƣợc đổ vào các đĩa Petri (10ml môi trƣờng/ đĩa petri). Sau khi môi trƣờng đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào giữa đĩa petri (Hình 2.1)
Cách bố trí trên đĩa peptri:
Hình 2.1: Sơ đ bố trí th nghiệm hiệu quả của thuốc hóa học đối với nấm Trichoconis sp.
ho c Aspergillus sp. gây lem l p hạt l a
Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh lem lép hạt (đƣờng kính 5mm)
Môi trƣờng đã có thuốc hóa học theo nồng độ tính sẵn
24
h tiêu ghi nhận: Ghi nhận đƣờng kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm
24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty hoặc chỉ tiêu đƣợc ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng phát triển đến mép đĩa petri.
Hiệu quả của thuốc đƣợc tính theo công thức: (ĐKKTđc – ĐKKTi)
HQT(%) = x 100 ĐKKTđc
Trong đó: ĐKKTđc: Đƣờng kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng ĐKKTi: Đƣờng kính khuẩn lạc của nghiệm thức thuốc i
Qua kết quả thí nghiệm 1 sẽ chọn ra 2 nghiệm thức cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao nhất để thực hiện cho thí nghiệm.
2.2.2. Thí nghiệm 2. Khảo sát hiệu quả của các loại dịch trích thực vật đối với
nấm Trichoconis sp. và Aspergillus sp. gây lem l p hạt l a in vitro
M c đích: Đánh giá hiệu quả của các loại dịch trích thực vật đối với nấm
Trichoconis sp. và Aspergillus sp. gây lem lép hạt lúa
Thực hiện thí nghiệm:
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 13 nghiệm thức (12 nghiệm thức sử dụng dịch trích thực vật và 1 nghiệm thức đối chứng), 5 lần lặp lại. Loại dịch trích thực vật và nồng độ dịch trích đƣợc trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trƣờng PDA không chứa dịch trích thực vật.
-Chuẩn bị nguồn nấm Trichoconis sp.và Aspergillus sp.: tƣơng tự thí nghiệm 1. - Các loại thực vật sau khi thu về sẽ đƣợc rửa sạch đất cát, sau đó đƣợc trích với nƣớc cất bằng cách tính nồng độ theo trọng lƣợng lá tƣơi/ thể tích, kế tiếp cho vào máy xay sinh tố xay nhuyễn, lƣợt bỏ phần xác thu phần nƣớc trích. Sau cùng rót phần dịch trích thu đƣợc qua dụng cụ lọc (có đƣờng kính lỗ lọc 0,2µm) vào 1 cốc thủy tinh đã thanh trùng khô, thao tác đƣợc tiến hành trong tủ cấy. Nấu tan môi trƣờng PDA. Khi chai môi trƣờng đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm đƣợc chai môi trƣờng bằng tay) chiết dịch trích thực vật đã chuẩn bị sẵn vào chai môi trƣờng, lắc chai môi trƣờng để dịch trích hòa tan đều vào môi trƣờng. Sau đó, môi trƣờng trong chai sẽ đƣợc chiết vào các đĩa Petri (chiết 10ml môi trƣờng/ đĩa petri).
25
Sau khi môi trƣờng đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào chính giữa đĩa petri (Hình 2.2).
Cách bố trí trên đĩa peptri:
Hình 2.2: Sơ đ bố trí th nghiệm hiệu quả của dịch trích thực vật đối với nấm Trichoconis
sp. ho c Aspergillus sp. gây lem l p hạt l a
h tiêu ghi nhận: Ghi nhận đƣờng kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm
24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty hoặc chỉ tiêu sẽ đƣợc ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng phát triển đến mép đĩa petri.
Hiệu quả của thuốc đƣợc tính theo công thức: (ĐKKTđc – ĐKKTi)
HQT(%) = x 100 ĐKKTđc
Trong đó: ĐKKTđc: Đƣờng kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng ĐKKTi: Đƣờng kính khuẩn lạc của nghiệm thức thuốc i
Qua kết quả thí nghiệm 2 sẽ chọn ra 2 nghiệm thức cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao nhất để thực hiện cho thí nghiệm 3.
Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh lem lép hạt (đƣờng kính 5mm)
Môi trƣờng đã có dịch trích thực vật theo nồng độ tính sẵn
26
2.2.3. Thí nghiệm 3. Đánh giá hiệu quả của các loại thuốc h a học và dịch trích thực vật đối với nấm Trichoconis sp. và Aspergillus sp. gây lem l p hạt l a in vitro
M c đích: Đánh giá hiệu quả của các loại thuốc hóa học và dịch trích thực vật
đã đƣợc chọn đối với nấm Trichoconissp. và Aspergillus sp. gây lem lép hạt lúa
Thực hiện thí nghiệm:
- Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức (2 nghiệm thức sử dụng thuốc hóa học có hiệu quả cao từ TN1, 2 nghiệm thức sử dụng dịch trích thực vật có hiệu quả cao từ TN2 và 1 nghiệm thức đối chứng), 5 lần lặp lại. Nghiệm thức đối chứng là môi trƣờng PDA không chứa thuốc hóa học hoặc dịch trích thực vật.
- Chuẩn bị nguồn nấm Trichoconis sp.và Aspergillus sp.: tƣơng tự thí nghiệm 1. - Cách tiến hành các nghiệm thức thuốc hóa học tƣơng tự thí nghiệm 1, đối với các nghiệm thức dịch trích thực vật cũng tƣơng tự thí nghiệm 2.
27
HƢƠNG 3.
KẾT QUẢ V THẢO LUẬN
3.1. HIỆU QUẢ ĐỐI KHÁNG IN VITRO CỦA 4 LOẠI THUỐC HÓA HỌC LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Trichoconis sp. VÀ Aspergillus sp. GÂY LÊN SỰ PHÁT TRIỂN CỦA NẤM Trichoconis sp. VÀ Aspergillus sp. GÂY BỆNH LEM LÉP HẠT LÚA
3.1.1 Nấm Trichoconis sp.
Bảng 3.1 ghi nhận ảnh hƣởng của các loại thuốc hóa học lên sự phát triển đƣờng kính khuẩn ty nấm Trichoconis sp. trong điều kiện in vitro. Ở thời điểm 48 và 72 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty (GSĐKT), ngoại trừ nghiệm thức xử lý Comcat 150WP nồng độ (0,064g/100ml), các nghiệm thức xử lý thuốc hóa học còn lại đều cho đƣờng kính khuẩn ty nấm nhỏ hơn có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Trung bình đƣờng kính khuẩn ty của các nghiệm thức xử lý hiệu quả lần lƣợt khoảng 0,5 – 1,3 cm (48 GSĐKT) và 0,5 – 2,1 cm (72 GSĐKT), của nghiệm thức đối chứng là 1,5 cm (48 GSĐKT) và 2,1 cm (72 GSĐKT). Kết quả về hiệu quả cũng đƣợc ghi nhận tƣơng tự ở hai thời điểm 96 và 120 GSĐKT. Đến thời điểm 144 GSĐKT, nghiệm thức xử lý với Comcat 150WP ở hai nồng độ (0,032g/100ml) và (0,064g/ml) không còn thể hiện khả năng ức chế sự phát triển đƣờng kính khuẩn ty nấm, trung bình đƣờng kính khuẩn ty nấm ở nghiệm thức này không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Các nghiệm thức còn lại vẫn tiếp tục thể hiện hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm. Ở thời điểm khảo sát cuối cùng (160 GSĐKT), nghiệm thức xử lý Comcat 150WP ở cả ba nồng độ không còn thể hiện khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm, trong khi các nghiệm thức xử lý với Tilt super 300EC, Rocksai Super 525SE và Man 800WP vẫn tiếp tục thể hiện khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Trichoconis sp. Đƣờng kính khuẩn ty nấm của các nghiệm thức ở thời điểm này lần lƣợt là Tilt super 300EC nồng độ (46,9µl/100ml) (0,58cm), Tilt super 300EC nồng độ (93,8µl/100ml) (0,52cm), Tilt super 300EC nồng độ (187,6µl/100ml) (0,52cm), Rocksai Super 525SE nồng độ (62,5µl/100ml) (2,32cm), Rocksai Super 525SE nồng độ (125µl/100ml) (1,60cm), Rocksai Super 525SE nồng độ (250µl/100ml) (0,76cm) và Man 80WP nồng độ (0,016g/100ml) (0,52cm), Man 80WP nồng độ (0,032g/100ml) (0,5cm), Man 80WP nồng độ (0,064g/100ml) (0,5cm), của đối chứng là 5,54cm.
28
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của các loại thuốc hóa học lên sự phát triển đƣờng kính (cm) của hu n ty nấm Trichoconis sp. trong điều iện in vitro
Nghiệm thức Thời điểm quan sát (giờ sau đặt khoanh khuẩn ty)
Loại thuốc Nồng độ 48h 72h 96h 120h 144h 160h
Tilt super 300EC 46,9µl/100ml 0,50 f 0,50 f 0,56 f 0,50 f 0,58 fg 0,58 g Tilt super 300EC 93,8µl/100ml 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,52 f 0,52 g 0,52 g Tilt super 300EC 187,6µ/100ml 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,52 f 0,52 g 0,52 g Rocksai Super 525SE 62,5µl/100ml 0,64 e 0,90 d 1,32 d 1,62 d 1,96 d 2,32 d Rocksai Super 525SE 125µl/100ml 0,52 f 0,72 e 0,94 e 1,14 e 1,36 e 1,60 e Rocksai Super 525SE 250µl/100ml 0,50 f 0,50 f 0,52 f 0,60 f 0,66 b 0,76 f Man 80WP 0,25g/100ml 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,52 f 0,52 f 0,52 g Man 80WP 0,5g/100ml 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 g Man 80WP 1g/100ml 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 f 0,50 g Comcat 150WP 0,016g/100ml 1,32 c 2,08 c 2,82 c 3,76 c 4,56 c 5,40 c Comcat 150WP 0,032g/100ml 1,16 d 2,08 c 2,74 c 3,68 c 4,70 b 5,58 b Comcat 150WP 0,064g/100ml 1,56 a 2,48 a 3,34 a 4,38 a 5,32 a 6,20 a Đối chứng 1,46 b 2,34 b 3,16 b 3,92 b 4,72 b 5,54 bc Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 8,01 5,48 4,77 4,78 4,61 5,12
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ; ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %
29
Bảng 3.2 ghi nhận hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Trichoconis sp. của các loại thuốc hóa học trong điều kiện in vitro. Ở thời điểm 48 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty nấm (GSĐKT) trừ nghiệm thức xử lý Comcat 150WP nồng độ (0,016g/100ml) và nghiệm thức xử lý Comcat 150WP nồng độ (0,064g/100ml), thì các nghiệm thức xử lý thuốc còn lại đều cho hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Trung bình hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm của các nghiệm thức xử lý có hiệu quả khoảng từ 20,6% - 65,7%. Đến thời điểm 72 và 96 GSĐKT, nghiệm thức xử lý với Comcat 150WP nồng độ (0,064g/100ml) không thể hiện hiểu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm, trong khi các nghiệm thức xử lý thuốc còn lại vẫn có hiệu quả ức chế cao có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Trung bình hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của các nghiệm thức có hiệu quả lần lƣợt khoảng 10,95% -78,6 % (72 GSĐKT), 10,8% - 84,2% (96 GSĐKT). Ở thời điểm 120 và 144 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty nấm, hầu hết các nghiệm thức xử lý Comcat 150WP ở cả 3 nồng độ không còn thể hiện hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm, trung bình hiệu quả ức chế của các nghiệm thức này không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê so với đối chứng không xử lý, các nghiệm thức xử lý thuốc còn lại vẫn cho hiệu quả ức chế cao. Kết quả đƣợc ghi nhận tƣơng tự ở thời điểm cuối 160 GSĐKT, nghiệm thức xử lý Comcat 150WP ở cả ba nồng độ không có hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm, nhƣng các nghiệm thức xử lý thuốc còn lại với Tilt super 300EC, Rocksai Super 525SE và Man 800WP vẫn đạt hiệu quả ức chế cao có ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý, hiệu quả ức chế của các nghiệm thức xử lý này lần lƣợt là Tilt super 300EC nồng độ (46,9µl/100ml) (89,53%), Tilt super 300EC nồng độ (93,8µl/100ml) (90,61%), Tilt super 300EC nồng độ (187,6µl/100ml) (90,59%), Rocksai Super 525SE nồng độ (62,5µl/100ml) (58,05%), Rocksai Super 525SE nồng độ (125 µl/100ml) (71,12%), Rocksai Super 525SE nồng độ (250µl/100ml) (86,27%) và Man 80WP nồng độ (0,25g/100ml) (90,61%), Man 80WP nồng độ (0,5g/100ml) (90,97%), Man 80WP nồng độ (0,1g/100ml) (90,97%).
30
Bảng 3.2. Hiệu quả ức chế sự phát triển hu n ty nấm Trichoconis sp. của các loại thuốc h a học trong điều iện in vitro
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 %; ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %
Nghiệm thức Thời điểm quan sát (giờ sau đặt khoanh khuẩn ty)
Loại thuốc Nồng độ 48h 72h 96h 120h 144h 160h
Tilt super 300EC 46,9µl/100ml 65,65 a 78,61 a 82,30 a 85,19 a 87,72 a 89,53 a Tilt super 300EC 93,8µl/100ml 65,65 a 78,61 a 84,17 a 86,71 a 88,98 a 90,61 a Tilt super 300EC 187,6µ/100ml 65,65 a 78,61 a 84,17 a 86,73 a 88,97 a 90,59 a Rocksai Super 525SE 62,5µl/100ml 56,11 a 61,49 a 58,23 b 58,66 a 58,45 a 58,05 a Rocksai Super 525SE 125µl/100ml 64,23 a 69,25 a 70,26 ab 70,93 a 71,22 a 71,12 a Rocksai Super 525SE 250µl/100ml 65,65 a 78,61 a 83,53 a 84,71 a 86,00 a 86,27 a
Man 80WP 0,25g/100ml 65,65 a 78,61 a 84,17 a 86,74 a 88,97 a 90,61 a Man 80WP 0,5g/100ml 65,65 a 78,61 a 84,17 a 87,24 a 89,40 a 90,97 a Man 80WP 1g/100ml 65,65 a 78,61 a 84,17 a 87,24 a 89,40 a 90,97 a Comcat 150WP 0,016g/100ml 9,55 bc 10,95 b 10,75 c 4,04 b 3,34 b 2,46 b Comcat 150WP 0,032g/100ml 20,61 b 10,95 b 13,29 c 6,03 b 0,38 b 0,00 b Comcat 150WP 0,064g/100ml 0,00 c 0,09 c 0,00 d 0,00 b 0,82 b 0,00 b Đối chứng 0,00 c 0,00 c 0,00 d 0,00 b 0,00 b 0,00 b Mức ý nghĩa * * * * * * CV (%) 8,01 7,04 5,37 5,65 7,14 6,70
31
Nhƣ vậy, từ kết quả đã phân tích ở bảng 3.1. và 3.2., trong 4 loại thuốc dùng để khảo sát hiệu quả ức chế trên nấm Trichoconis sp., thì trừ nghiệm thức xử lý với thuốc hóa học Comcat 150WP không thể hiện hiệu quả ức phát triển đƣờng kính khuẩn ty nấm, các nghiệm thức xử lý thuốc với Tilt super 300EC, Rocksai Super 525SE và Man 80WP đều có hiệu quả ức chế phát triển khuẩn ty nấm Trichoconis
sp. và đều cho kết quả khác biệt ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng không xử lý. Trong ba loại thuốc cho hiệu quả thì Tilt super 300EC và Man 80WP cho hiệu quả ức chế khuẩn ty cao nhất, ngay từ nồng độ A (nồng độ bằng ½ khuyến cáo) đã thể hiện hiệu quả cao. Kết quả của Tilt super 300EC tƣơng tự kết quả của Trần Văn Hai (1999) và Hồ Văn Thơ (2007). Trần Văn Hai (1999) thử thuốc trên
Trichoconis padwickii bằng phƣơng pháp đặt khoanh khuẩn ty đƣờng kính 7mm vào môi trƣờng PSA, thì Tilt 250EC cũng cho hiệu quả ức chế khuẩn ty nấm cao có ý nghĩa thống kê so với đối chứng. Hồ Văn Thơ (2007) đã khảo sát hiệu quả của Tilt super 300EC và Dithane M - 45 80WP trên nấm Trichoconis padwickii, cùng một phƣơng pháp tiến hành và đều cho kết quả ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm cao khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý. Butt và ctv. (2011) đã sử dụng phƣơng pháp ngâm hạt, khảo sát hiệu quả của các loại thuốc trên nấm
Alternaria sp. thì Mancozeb cũng cho hiệu quả ức chế nấm phát triển có khác biệt ý nghĩa thống kê so với đối chứng không xử lý. Hai nghiệm thức Tilt super 300EC (46,9µl/100ml) và Man 80WP (0,25g/100ml) sẽ đƣợc sử dụng để tiếp tục thực hiện thí nghiệm 3.
32
Hình 3.1: Sự phát triển khu n ty nấm Trichoconis sp. của các nghiệm thức Man 80WP và
Rocksai super 525SE sau năm ngày th thuốc.
Rocksai super 525SE (0,064µl/100ml)
Đối chứng
Man 80WP (0,25g/100ml) Man 80WP (0,5g/100ml)
Man 80WP (0,1g/100ml)
Rocksai super 525SE (0,016) Rocksai super 525SE
33
Hình 3.2: Sự phát triển khu n ty nấm Trichoconis sp. của các nghiệm thức Tiltsuper 300EC
và Comcat 150WP sau năm ngày th thuốc.
Tilt super 300EC (46,9µl/100ml)
Đối chứng Tilt super 300EC (93,8µl/100ml)
Tilt super 300EC (187,6µl/100ml) Comcat 150WP (0,016g/100ml) Comcat 150WP (0,032g/100ml) Comcat 150WP (0,64g/100ml)
34
3.1.2. Nấm Aspergillus sp.
Ảnh hƣởng của các loại thuốc hóa học lên sự phát triển đƣờng kính khuẩn ty nấm Aspergillus sp. trong điều kiện in vitro đƣợc trình bày ở Bảng 3.3. Ở thời điểm 48 và 72 giờ sau đặt khoanh khuẩn ty nấm, tất cả các nghiệm thức xử lý thuốc đều có khả năng ức chế sự phát triển đƣờng kính khuẩn ty nấm Aspergillus sp. cho