1 .4.4 ù ig dụng trong tổng hợp các baseMannich của một số dẫn
2.3.4. Phân tích phổ khối lượng (MS)
Phổ khối được ghi trên máy HP-5989-MS tại phòng phân tích cấu trúc, Viện Hóa học (Viện khoa học và công nghệ Việt Nam).
Do điều kiện hạn chế chúng tôi chỉ ghi phổ của 3 chất (1, 2, 6).
Phổ đồ của các chất được ghi ờ các hình 13-15. Kết quả phân tích phổ khối của các chất cho thấy đều có pic phân tử. có số khối đúng bằng số khối của chất dự kiến. Ngoài ra phân tích phổ đồ cho phép nhận biết các pic phân mảnh của bốn chất này phù hợp vói sơ đồ phân mảnh và phù hợp với các tài liệu tham khảo được[16],[17],[32]. Riêng chất (6) không có pic phân tử, vì có cấu tạo alcol nên ion phân tử không bền, nhưng có thể nhận thấy các ion mảnh
đặc trưng của alcol là M-H2O (M-18) và sự phân cắt a đã tạo ra hai ion mảnh
đặc trưng của hai hợp phần là m/z 151 (p-nitrobenzaldehyd) và m/z 1 0 0 (hydantoin). Ngoài ra trên phổ đồ cũng có các pic phân mảnh phù hợp sơ đồ phân mảnh.
Chất Công thức cấu tạo m/z o- \ -N—H -CH= ĩ H M = 233,18 233 (M^) 162 (M ^-H N CO -CO ) 132 (162 - NO) 1 1 6 ( 1 6 2 - N 0 2 ) 89(116-H C N ) 63 (89 - C2H2) 0,N- N — C H2- N O ' v _ y M = 332,32 332 (M^) 233 (MH - cH2- ĩ ^ - Q o 162 (23 3 -H N C O -N O ) 132 (162-N O ) 1 1 6 ( 1 6 2 - N 0 2 ) 100 ( - ch2-ĩH Co) 8 9(116-H C N ) 63 (8 9- C 2H2) M = 251 233 (M -1 8 ) 162 (M -H N C O -C O ) 151 1 0 5 ( 1 5 1 - N 0 2 ) 100 ( NH o) 77 (105-C O ) 72 (100-C O ) 57(100-H N C O )
---N— CH,—N o - I + . CH=C=NH + m /z 89 ■C2H3 C5HÎ m/z 63
/ ) ~ T m/z 251 -HoO 1+ IH I* •NH m/z 233 0 2^ —^ ^ C H = 0 m/z 151 m/z 1 0 0 -N0*2 -C O -H N C O ^ 7 7 1+ ^ ____1— ĩ ĩ ĩ l ^ - H N - l ^ m /zl05 -C O + + C6H5 m/z77 2.4. Thử tác dụng sinh học. 2.4.1. Thử tác dụng kháng khuẩn
Chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của sáu chất tổng hợp được (1-6) với tám chủng vi khuẩn tại phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam).
* Nguyên tắc:
Tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu theo phưcmg pháp của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994).
Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
-Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922);
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923).
-Vi khuẩn Gr (+): Bacilus subtillis (ATCC 27212);
Staphylococcus aureus.
-Nấm sợi: Aspergillus niger,
Fusarium oxysporum.
-Nấm men: Candida albicans',
Saccharomyces cerevỉsiaẹ
* Tiến hành
- Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Saboraud dextrose broth và Trypcase soya broth (TSB). Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với vi nấm).
- Mẫu thử hòa tan trong dung dịch DMSO 100%: với 4-10 thang nồng độ được pha loãng từ dich gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi được hoạt hóa được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tói nồng độ tương đương 0.5 đcm vị McLand (khoảng 10* vsv/ml). Để trong tủ ấm 37°c/24h đối với vi khuẩn và 30°c/48h đối vói vi nấm. Sau đó đọc kết quả và tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Các mẫu chất tinh khiết có MIC < 50 ftglml là có hoạt tính.
Kết quả thử nghiệm được ghi ở bảng 7:
*Kết quả
+ Về tác dụng kháng khuẩn: Có ba chất thể hiện tác dụng:
- Chất (2) có tác dụng với một chủng vi khuẩn S.aureus(MIC = 50|Lig/ml).
- Hai chất (3,4) có tác dụng với một chủng vi khuẩn B.subtỉllis
(MIC=50|ag/ml).
+ Về tác dụng kháng nấm: Có bốn chất (2-5) thể hiện tác dụng với chủng
Chất thử
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: ^ /m l)
Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn (+) Nấm mốc Nấm men
Ẹcoli p.aeruginosa B.subtillis S.aureus Asp.niger F.oxysporum S.cerevisiae C.albicans
1 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 (-) (-) (-) 50 (-) (-) 50 (-) 3 (-) (-) 50 (-) (-) (-) 50 (-) 4 (-) (-) 50 (-) (-) (-) 50 (-) 5 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 50 (-) 6 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)
Một số công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước đã công bố kết quả thử hoạt tính chống tế bào ung thư của một số dẫn chất của hydantoin[5],[6],[10],[ll],[38]. Các kết quả đó đã định hướng chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người của một số dẫn chất của hydantoin do chúng tôi tổng hợp với mong muốn góp phần tìm kiếm các thuốc chống ung thư.
2.4.2.Ị Nguyên tắc
Tiến hành theo phương pháp của Likhiwitayawuid đang được tiến hành tại viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
Dòng tế bào nghiên cứu:
+ Hep-2: Dòng tế bào ung thư gan
+ Lu : Dòng tế bào ung thư phổi
2Ạ2.2. Tiến hành
- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện ở phòng Sinh học thực nghiệm, viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc viện Khoa học và công nghệ Việt Nam theo quy trình sau đây:
- Tế bào ung thư được duy trì liên tục ở điều kiện chuẩn. Sau khi tế bào được hoạt hóa phát triển đến phase log, sẽ được sử dụng cho test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4-10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại 3 lần trên vi lượng 96 giếng trong dung môi dimethylsulfoxyd (DMSO).
- Phiến thử nghiệm được ủ trong tủ ấm C02/37°C/48-72h để tế bào tiếp tục phát triển, bao gồm: Tế bào + môi trường nuôi cấy + mẫu thử. Sau đó lấy ra cố định tế bào, rửa, nhuộm tế bào và hòa lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy Elisa, bước sóng 495-515nm.
- Nồng độ ức chế tế bào ung thư của chất thử được tính bằng giá trị ICgo- Giá trị này được tính trên chương trình Table curve với giá tri logarit dựa trên giá trị dãy các thang nồng độ khác nhau của chất thử và giá trị mật độ quang (optical density - OD) đo được.
Các mẫu tinh khiết có giá trị ICịq <5ịỉglml được coi là có hoạt tính.
Do điều kiện kinh phí có hạn chúng tôi chỉ chọn ra ba chất là (1, 2, 6) để thử tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư ngưòị
Kết quả thử nghiệm được ghi ở bảng 8:
Bảng 8: Kết quả thử hoạt tính kháng các dòng tê bào ung thư ngưòi của chất thử. Chất Hep-2 Lu Kết luận IC50 (ng/ml) % tế bào sống sót IC50 (ng/ml) % tê bào sống sót 1 3,70 38,9±0,9 >5 88,89±0,0 Dương tính một dòng 2 2,77 36,6±0,4 >5 68,96±0,4 Dương tính một dòng 6 >5 65,2±1,5 >5 75,6±0,05 Âm tính
Kết quả cho thấy có hai chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan (chất (1): IC50=3,70|ug/ml; chất (2): IC50 =2.77|^g/ml) và không có tác dụng kháng tế bào ung thư phổi (IC50>5). Còn chất (6) không có hoạt tính với cả hai dòng tế bào Hep-2 và Lụ
2.5. Bàn luận
2.5.1. Về tổng hợp hóa học
* Đã khảo sát, so sánh 3 phương pháp ngưng tụ p-nitrobenzaldehyd vói
hydantoin là: dùng xúc tác AcONa trong AcOH (PPl), dùng xúc ethanolamin trong nước (PP2) và dùng amoni bicarbonat trong nước (PP3) để tìm điều kiện phản ứng thích hợp, cho hiệu suất cao và kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Phản ứng ngưng tụ được tiến hành theo hai phương pháp (PPl và PP2) đều cho cùng một sản phẩm (chất 1) với hiệu suất là tương đương nhau (47%), tuy nhiên PP2 được tiến hành trong điều kiện nhẹ nhàng hơn (dung môi nước và nhiệt độ phản ứng dưới 100°C).
+ Đối với PP3 thì thời gian phản ứng rất ngắn, hiệu suất cao song chỉ cho được sản phẩm kiểu aldol (chất 6), có lẽ do xúc tác amoni carbonat có lực base yếụ
* Phản ứng Mannich được tiến hành ở 85°c và tỷ lệ số mol các chất tham
gia phản ứng ( 1 : formaldehyd : amin) đều cho sản phẩm là các base
monoMannich. Kết quả này được khẳng định khi phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ. Theo chúng tôi có lẽ do khả năng phản ứng của nhóm -NH-amid yếu hơn nhóm -NH-imid cùng vối sự cản trở không gian của nhóm thế C-5 nên không thu được dẫn chất base diMannich như hydantoin không thế. Khi tiến hành phản ứng ở điều kiện trên thì cho hiệu suất tương đối cao và thời gian phản ứng ngắn.
2.5.2. Về xác định cấu trúc
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ đã cho thấy cấu trúc của các chất tổng hcfp đúng như dự kiến.
2.5.3. Vê tác dụng sinh học
- Kết quả thử sơ bộ cho thấy các chất có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm không đáng kể.
- Kết quả thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người cho thấy có hai chất ( 1 và 2) có tác dụng kháng dòng tế bào ung thư gan khá mạnh, còn chất (6) không có tác dụng.
* Về mối liên quan giữa cấu trúc - tác dụng kháng tế bào ung thư gan chúng tôi có nhận xét sơ bộ sau:
+ Yếu tố cấu trúc khung phân tử 5-(p-nitrobenzyliden)-hydantoin đã
mang lại hoạt tính kháng dòng tế bào ung thư gan, thể hiện ở chất (1) và (2)
+ Chất (2) có hợp phần amin bậc hai có hoạt tính mạnh hơn chất gốc là chất (1). Nguyên nhân có thể do cấu trúc phân tử khác nhau, chất (2) do cấu trúc phân tử và độ tan trong nước cao hofn chất (1) nên khả năng thấm qua
màng tế bào dễ hơn nên gây ra tác dụng mạnh hơn. Còn chất (6) (có cấu trúc kiểu aldol) thì không có tác dụng kháng tế bào ung thư.
Về mặt cấu trúc hóa học thì chất (1) là sản phẩm loại nước của chất (6). Từ sự khác nhau về cấu trúc và hoạt tính kháng tế bào ung thư của hai chất (1)
và (6) có thể nhận thấy vai trò của nhóm carbonyl a,p - không no đối với tác dụng của dãy chất 5-aryliden-hydantoin như đã được công bố và nhận xét ở các công trình nghiên cứu khác[5],[10],[ll].
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. Kết luận
1. Chúng tôi đã tổng hợp được 6 chất gồm: 5-(p-nitrobenzyliden)-
hydantoin (1), 5-(p-nitro-ạ-hydroxybenzyl)hydantoin (6) và 4 dẫn chất
baseMannich của chất (1) (2 - 5)
2. Đã khảo sát phản ứng ngưng tụ của hydantoin vói p-nitrobenzaldehyd theo ba phương pháp. Kết quả cho thấy với tác nhân ngưng tụ là natri acetat trong môi trường acid acetic băng (PPl) và ethanolamin trong môi trường nước (PP2) thì thu được sản phẩm ngưng tụ (chất 1), còn với tác nhân ngưng
tụ là amoni bicarbonat trong môi trường nước chỉ thu được sản phẩm cộng hợp kiểu aldol (chất 6).
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM, xác định cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, tử ngoại và khối phổ. Kết quả cho phép chúng tôi kết luận các chất tổng hợp được đúng như dự kiến.
4. Thử tác dụng kháng khuẩn của 6 chất tổng hợp được (1- 6) với 2 chủng
vi khuẩn Gram (+), 2 chủng vi khuẩn Gram (-) và 4 chủng vi nấm. Kết quả cho thấy chất ba chất (2, 3, 4) có tác dụng ức chế yếu với một chủng vi khuẩn
và một chủng vi nấm, chất (5) chỉ có tác dụng với một chủng vi nấm.
5. Đã thử tác dụng kháng tế bào ung thư của 3 chất (1, 2, 6) với hai dòng
tế bào ung thư ở người là tế bào ung thư gan (Hep-2) và tế bào ung thư phổi (Lu). Kết quả cho thấy có hai chất (1, 2) có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan
3.2. Đề xuất
+ Về tổng hợp hóa học: Cần tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thêm các dẫn chất baseMannich của 5-(p-nitrobenzyliden) hydantoin.
+ Về tác dụng sinh học: Cần tiếp tục thử đầy đủ hơn hoạt tính chống ung thư của ba chất (3, 4, 5) nhằm nhận định đầy đủ hcfn hoạt tính chống ung thư của dãy chất nàỵ
Chúng tôi cho rằng việc tiếp tục tổng hợp và sàng lọc hoạt tính sinh học của các dẫn chất hydantoin, đặc biệt là hoạt tính chống ung thư của các 5- arylidenhydantoin và các dẫn chất baseMannich của chúng là cần thiết và có triển vọng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Bộ môn Hóa dược (2006), Hóa dược, Trưrmg đại học Dược Hà Nội, tập I, tr. 51-52.
2. Bộ môn Hóa hữu cơ (1999), Hóa hữu cơ, Trường Đại học Dược Hà Nội, tập II, tr.215-230.
3. Dược điển Việt Nam IU (2002), Nhà xuất bản Y học, tr.218.
4. Heinz Beaker và cộng sự (1967), Thực hành hóa hữu cơ, Phan Tống Sơn, Lê Đăng Doanh dịch, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tr. 88-91, 109-114.
5. Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Vũ Trần Anh và cộng sự (2006), Tổng hợp và thử hoạt tính chống ung thư của một số dẫn chất 5-
arylidenhydantoin, Tạp chí Dược học, IIA , tr.50-54.
6. Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Vũ Trần Anh, Nguyễn Thị Thu
Hương (2005), “Tổng hợp và thử hoạt tính chống ung thư của một số dẫn xuất của hydantoin”, Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và công
nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ 3, Nhà xuất bản Đại học Quôc gia
Hà Nội, tr.41-45.
7. Đinh Thị Hải (2003), 'Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của S-{J
nỉtrobenzyliden)-imidazolỉdin-2,4-dion và dẫn chấf \ Khoá luận tốt nghiệp
Dược sỹ đại học, tr. 17,18,26.
8. Đinh Thị Thanh Hải, Nguyên Quang Đạt, Lê Mai Hương (2003), “Nghiên
cứu hoạt tính gây độc tế bào của một số dẫn chất 5-nitrofurfurar’, Tạp chí
Dược học, 7, tr.14-15.
9. Nguyên Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Việt Hà (2002), “Tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-(5’-nitro-2’- furfuryliden)-imidazolidin-2,4-dion và dẫn chất”, Tạp chí Dược học, 7, tr. 14. 15
10. Đậu Công Hồng (2006), “Tổng hợp và thử hoạt tính chống ung thư của
một số dẫn chất của hỵdantoin”, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học,
tr.21-22, 36-38.
11. Nguyễn Thị Thu Hương (2004), “Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của 5-(p-cloro-benzyliden)-imidazolidin-2,4 -dion và dẫn chất”, Khoá luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, tr.l 8-27, 41-42.
12. Nguyễn Thị Xuân Thuỷ, Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt (1991), “Nghiên cứu tổng hợp dẫn chất furfural có tác dụng dược lý”, Tạp chí
Dược học, 1, tr.4,
13. Nguyễn Thị Xuân Thuỷ, Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải (1993),“Tổng hcfp một số dẫn chất baseMannich của
nitrofurantoin và thăm dò tác dụng dược lý”, Tạp chí Dược học, 2, tr.14-16
14. Vũ Ngọc Thuý, Tào Duy Cần (1989), Thuốc và cách sử dụng, Nhà xuất
bản khoa học kỹ thuật, tr.440, 446.
15. Thái Doãn Tĩnh (2001), Cơ sở lý thuyết hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tập 2, tr.388-396.
16.Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa
học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nộị
17.Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và hoá lý,
Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội, tập 1.
18.Hoàng Tích Tuyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông (1998), Dược lý
học, Nhà xuất bản Y học, tr.225-227.
19. Hoàng Trọng Yêm (chủ biên) (2000), Hóa hữu cơ, Nhà xuất bản Khoa
học Kỹ thuật, Tập 3, tr. 150-152.
Tiếng Anh
20.J. F. c. Albuquerque, J. Ạ Rocha Filho, s. s. F Brandao, M. c. Ạ Lima, Ẹ Ạ Ximenes, s. L. Galdino, Ị R. Pitta, c. Luu- Due, J. Chantegrel, M.
Perissin (1999), “Synthesis, and antimicrobial activity of substituted
imidazollidindiones and thioxo imidazollidindiones”, II Farmaco 54, p.77-
82.
21. C. C. Bombardieri, Ạ Taurins (1955) “The mannich condensation of
compounds containing acidic imino groups”, Canadian Journal of
Chemistry, Vol. 33, p. 923-927.
22. G. Billek (1962), “Condensation of aromatic aldehydes with hydantoin”.
Ibid. p.352-360.
23. H. W. Bond (1948), “Synthesis of carboxyl-labelled tryptophan from
hydantoin containing isitopic carbon”, J. Biol. Chem. 175,531.
24. T. Dylag et al. (2004), Synthesis and evaluation of in vivo activity of
diphenylhydantoin basic derivatives”, Eur. J.Med. Chem., 39, 1013-1027.
25. Ạ Kleeman, T. Lusullbug, W. Pfeifer, D. Scherberich (1982), “Process for
the Production of 5-Aryliden Hydantoins”, ỤS. Patent 4.305.072.
26. M. C. Ạ Lima, D. L. Costa, Ạ J. Goes, S. L. Galdino, Ị R. Pitta, C Luu- Duc(1992),“Synthesis and antimicrobial activity of chlorobenzyliden imidazolidindiones derivatives and substitutedthioxoimidazolidindiones”.
Die Farmazie 47, p.77-86.
27. Leone (2001) ''Synthesis and chromatography of [RuCp]^-labelled diaryl
ether peptoids as precursors of the bastadins from the margin sponge
lanthella bastá\ Dissertation for the degree of doctor of natural Sciences,
Ruberto-Carola Universiti of Heidelberg, Germanỵ
28. S. B Mirviss (1986), Synthesis of unsaturated hydantoin with an
inexpensive catalyst, Ụ S. Patent, 4582903.
29. J. Marton, J. Enisz, S. Hostafi, T. Timar (1993) “Preparation and Fungicidal Activity of 5-Substituted Hydantoins and Their 2-Thio
30. Kirk Othme (1966), Encyclopedia of Chemical technology, 2"^* ed, Vol. Il,p .l4 1 -1 6 4 .
31.ẠP. Philips, J.G. Murphy (1951), “The condensation of aromatic aldehydes with hydantoin, J. Org. Chem, 16, tr.954-962.
32. R. M. Silverstein, G. c. Bassler, J. c. Morel (1981), Spectrometric
indentification of organic compounds, 4* edition, John Wiley, NewYork.
33. Ẹ Szymanska, K. Kiéc-Kononowicz (2003), “Antimycobecterial activity of 5-aryliden aromatic derivatives of hydantoin”, II Farmaco 57, p.909- 916.
34. T. Szanto (1960), “ Condensation of p-nitrobenzaldehyde with hydantoin”,
Chemistry and Industry, tr. 1269-1270