2.5.1. Kỹ thuật ly trích Deoxyribonucleic Acid (DNA)
Để thực hiện những kiểm nghiệm về bộ gen của sinh vật, DNA cần được ly trích một cách chính xác để đảm bảo sự thành công cho những bước kế tiếp. Nguyên tắc của quá trình này là phá vỡ thành tế bào để thu được DNA. Tùy vào nguồn gốc tế bào ly trích mà những kỹ thuật thích hợp sẽ được áp dụng. Nhìn chung, quá trình ly trích thường trải qua các bước sau:
− Chuẩn bị mẫu: Quá trình được phân chia tùy vào đối tượng. Đối với thực vật, mẫu thường lấy là lá. Với động vật, mẫu chính là mô trên cơ thể. Với vi khuẩn, cần thực hiện nuôi tăng sinh trước khi ly tâm để thu lấy mẫu.
− Phá vỡ tế bào: Có thể sử dụng phương pháp cơ học như ly tâm, nghiền mẫu hoặc phương pháp hóa học như sử dụng SDS (Sodium dodecyl sulfate) hay proteinase.
− Hòa tan DNA với dung dịch đệm TE pH 8,0 để hòa tan và giúp DNA không bị biến tính.
− Tinh sạch DNA: Để loại bỏ các thành phần không cần thiết, có thể sử dụng các chất hóa học như proteinase K, CTAB, chloroform,...
− Sau khi loại bỏ, DNA sẽ được tủa bằng ethanol 96% hoặc isopropanol ở –20°C. DNA thu được có dạng cô đặc, giúp bảo vệ sản phẩm đã làm ra khỏi các enzyme.
− DNA sẽ được rửa lại bằng ethanol 70% để loại muối và isopropanol. Sau đó, DNA được làm khô bằng cách phơi ở nhiệt độ phòng để loại bỏ lượng ethanol thừa.
− Để kiểm tra chất lượng sản phẩm, có thể sử dụng phương pháp điện di trên gel để kiểm tra khối lượng DNA hoặc đo quang phổ để xác định tỷ lệ giữa protein và DNA.
2.5.2. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction (PCR) là kỹ thuật nhân bản DNA từ bên ngoài cơ thể sinh vật được Kary Mullis và công sự phát minh vào năm 1985. Nguyên tắc của phương pháp PCR là sao bản đoạn DNA mong muốn từ khuôn mẫu. DNA sẽ được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn, dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase. Kỹ thuật này được đánh giá cao nhờ tính chính xác và nhanh. Tổng thể tích cho một phản ứng PCR khoảng
− Sợi khuôn DNA.
− DNA Taq–polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
− Đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp đoạn DNA mong muốn. − Bốn loại deoxyribonucletit triphosphate (dATP, dTTP, dGTP và dCTP).
− Dung dịch đệm tạo môi trường thuận lợi cho hoạt động và giúp ổn định enzyme Taq–polymerase. Thường trong dung dịch đệm cũng sẽ cung cấp ion Mg2+ cho phản ứng.
− Nước tinh khiết (BiH2O) không chứa enzyme RNase và DNase.
Mỗi phản ứng được thực hiện với nhiều chu kì nhiệt với 3 giai đoạn chính:
− Giai đoạn biến tính (denaturation): Giai đoạn thường dài 1 – 2 phút ở 92 – 96°C. Nhiệt độ cao làm phá vỡ cầu nối hydrogen giữa 2 chuỗi DNA, biến DNA từ dạng xoắn kép thành 2 mạch đơn.
− Giai đoạn bắt cặp (annealing): Đây là giai đoạn thực hiện quá trình bắt cặp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Thời gian và nhiệt độ của giai đoạn này cần có sự chính xác, nếu không sẽ dẫn đến việc mồi bị gắn sai hoặc không gắn được vào DNA khuôn mẫu. Giai đoạn bắt cặp thường kéo dài khoảng 1 – 2 phút ở nhiệt độ khoảng 45 – 60°C.
− Giai đoạn kéo dài (extension): Ở giai đoạn này, việc tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc được thực hiện. Enzyme DNA polymerase gắn tiếp vào đoạn DNA đã bắt cặp giữa mồi và DNA khuôn rồi hoạt động dọc theo chiều dài sợi DNA. Nhiệt độ và thời gian phụ thuộc vào DNA polymerase sử dụng. Chiều dài đoạn khuyếch đại cũng là yếu tố quyết định đến thời gian giai đoạn kéo dài.
Trong chu kì nhiệt đầu tiên, quá trình biến tính DNA diễn ra lâu hơn ở những chu kì sau. Nguyên nhân là để đảm bảo các sợi DNA đã tách rời hoàn toàn, đồng thời ổn định chúng. Quy trình PCR thường được kéo dài từ 35 – 40 chu kì nhiệt. Sau khi hoàn thành chu kì nhiệt cuối cùng, DNA được giữ thêm ở một giai đoạn từ 5 – 15 phút ở 70 – 74°C để đảm bảo cho tất cả các chuỗi đơn được bổ sung hoàn toàn. DNA được giữ lạnh từ 4 – 15°C để thực hiện những phản ứng kế tiếp.
2.5.3. Kỹ thuật điện di
Kỹ thuật điện di là kỹ thuật phân tích khối lượng dựa trên hiện tượng di chuyển của vật thể mang điện dưới tác động của môi trường. Đây là kỹ thuật được áp dụng để phân tích các vật liệu di truyền, protein dựa trên điện tích, điểm đẳng điện, hình dạng và kích cỡ của chúng. Lực kéo của điện trường sẽ làm cho các phân tử tích điện di chuyển trên bản gel (agarose hoặc polyacryamide). Tùy vào kích thước của chất phân tích và việc sử dụng các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, xanh coomassie) sẽ cho những band ở vị rí khác nhau sau khi điện di. Các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn. Kích thước của band có thể được xác định bằng việc so sánh với thang chuẩn DNA có chứa các DNA đã biết trước kích thước. DNA thường dùng để làm thang chuẩn là “100bp plus DNA Ladder”.
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian – địa điểm
Luận văn được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 12/2013. Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Nguyên vật liệu
− Men bánh mì khô nhãn hiệu Instant Success Nhãn Vàng, doanh nghiệp Cát Tường. − Bột mì Táo đỏ đa dụng.
− Mật ong Long Xương. − Bơ Meizan Tường An. − Muối.
3.1.3. Thiết bị và dụng cụ
− Màng bao thực phẩm, thau, tô nhựa, cân điện tử, ống đong, ống pha loãng, micropipette, bình tam giác, đĩa petri, đèn cồn, que cấy, que trải mẫu,...
− Nồi khử trùng PBI International 22793, kính hiển vi Olympus DP12 BX41, tủ lạnh Sanaky Tokyo– Japan,...
3.1.4. Hóa chất
Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS (De Man, Rogosa and Sharpe): Peptone, beef extract, yeast extract, glucose, Tween 80, dipotassium hydrogen phosphate,...
Các hóa chất dùng cho việc định danh sơ bộ: Crystal violet, Gram’s iodine, ethyl alcohol, saranin, hydrogen peoxide 3%, malachite green solution 7,6%,...
Các hóa chất cho việc định danh: SDS, Proteinase K, TE Buffer, Primer,... Các hóa chất khác: cồn, acid lactic, acid acetic, NaOH 0,1 N,...
3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Chuẩn bị mẫu bột chua
Hình 8. Quy trình làm bột chua
(*Nguồn: Leisure, 2011)
3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn acid lactic từ bột chua lên men tự nhiên
Mục đích: Phân lập được những chủng LAB thuần từ bột chua lên men tự nhiên.
Phương pháp thực hiện:
− Pha loãng mẫu bột chua với nồng độ từ 10–4 đến 10–8. Cấy trải mẫu pha loãng trên môi trường thạch MRS (Phụ lục 2), ủ đĩa ở 37ºC trong 48 giờ.
− Sau khi ủ, chọn các khuẩn lạc rời rạc điển hình của LAB để tiến hành cấy chuyền trên môi trường MRS thạch, ủ đĩa ở 37ºC trong 48 giờ.
− Các chủng phân lập được được trữ giống trong ống nghiệm chứa MRS broth.
Trộn 300 g bột mì, 2 g men bánh mì và 300 mL nước ấm
Ngày 3: Bổ sung 150 g bột mì và 150 mL nước ấm Đậy nắp bằng vải thưa, để ở nhiệt độ phòng
Khuấy hỗn hợp 2 lần mỗi ngày
Ngày 4: Chuyển hỗn hợp vào tủ lạnh với nắp đậy hờ
Sử dụng
Bổ sung lại với một lượng tương đương hỗn hợp 1 bột mì: 1 nước ấm
1 tuần không sử dụng
Làm mới bằng cách lấy ra 150mL hỗn hợp
Chỉ tiêu theo dõi:
− Hình thái của khuẩn lạc và hình dạng của vi khuẩn.
− Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn qua các thí nghiệm gồm nhuộm Gram, phản ứng catalase, nhuộm bào tử và khả năng phân giải CaCO3.
3.2.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao
Mục đích: So sánh khả năng sinh acid lactic giữa các chủng LAB đã phân lập được và tuyển chọn chủng có khả năng lên men acid lactic cao.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 1 nhân tố, 3 lần lặp lại. Thí nghiệm sử dụng 1 mẫu đối chứng không chủng vi khuẩn.
Phương pháp thực hiện:
− Chủng các chủng LAB phân lập được vào mẫu bột chua với mật độ là 107 tb/mL được làm từ 40 g bột mì, Dough Yield (DY) = 300. Sử dụng nước ấm (khoảng 60°C).
− Ủ các mẫu bột chua tại 37ºC trong 4 giờ.
− Sử dụng bột chua để làm bánh mì theo công thức của Leisure (2011) (Hình 9). Nguyên liệu sử dụng gồm 200 g bột mì, 75 mL bột chua, 50 mL nước ấm, 3 g men bánh mì, 20 g mật ong, 20 mL bơ và 3 g muối.
Chỉ tiêu theo dõi:
− pH và lượng acid tổng (TA) của bột chua ở 0 và 4 giờ. − pH và TA của bánh mì sau khi nướng.
− Tỷ số thể tích/ trọng lượng của bánh.
Hình 9. Quy trình làm bánh mì bột chua
(*Nguồn: Leisure, 2011)
3.2.4. Định danh chủng vi khuẩn acid lactic có khả năng lên men acid lactic cao
Mục đích: Xác định tên khoa học của chủng LAB có khả năng lên men acid lactic cao.
Phương pháp thực hiện:
− Chuẩn bị mẫu: Chủng LAB sẽ được nuôi trong môi trường MRS broth ở 37°C. − Ly trích DNA:
Cho 2 mL dịch nuôi vi khuẩn vào ống eppendoft.
Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu lấy sinh khối vi khuẩn ở bên dưới. Cho vào mỗi túyp 250 μL TE pH 8,0 để hoàn tan kết tủa bên trong.
Cho vào túyp 50 μL dung dịch 10% SDS và 5 μL Proteinase K. Trộn đều các nguyên liệu
Nhào bột trong 15 phút
Cho bột nhào vào tô, đậy lại bằng màng bao thực phẩm trong 1 giờ
Đấm bột
Gói bằng màng bao thực phẩm trong 1 giờ
Nướng bánh ở 100ºC trong 30 phút Nướng ở 150ºC trong 30 phút kế
Cho vào túyp 400 μL CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid)/0,7 M NaCl rồi ủ túyp ở 65°C trong 20 phút. Cần đảo túyp sau mỗi 5 phút.
Bổ sung vào túyp 600 μL dung dịch chloroform:alcohol tỉ lệ 24:1. Trộn đều mẫu rồi ly tâm túyp ở 12000 vòng/phút trong 10 phút.
Chuyển khoảng 500 μL phần trong vào 1 túyp mới rồi bổ sung thêm 1 mL isopropanol, lắc đều. Cần giữ túyp ở –20°C trong 30 phút.
Ly tâm túyp ở 13000 vòng/phút rồi loại bỏ phần dịch trong bên trên.
Rửa tủa với 1 mL ethanol 70%, rồi đêm đi ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lặp lại thao tác rửa tủa 2 lần.
Loại bỏ ethanol và để túyp khô ở nhiệt độ phòng. Hòa tan DNA với 30 μL BiH2O, trữ ở –20°C.
Kiểm tra sản phẩm bằng xác định tỉ số OD ở hai bước sóng 260nm và 280nm. − Quy trình PCR: Phản ứng PCR có tổng thể tích 25 μL được tiến hành trong eppendorf 1,5 mL. Các thành phần trong ống được miêu tả trong Bảng 2.
Bảng 2. Thành phần ống eppendorf cho phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μL) BiH2O 11,75 Buffer 2,5 MgCl2 2,0 dNTPs 4,0 DMSO 0,5 Primer F 0,25 Primer R 0,25 Taq–polymerase 0,25 DNA 2,0
Cặp mồi đặc hiệu được sử dụng có trình tự sau:
Phản ứng PCR được thực hiện trong 30 chu kì nhiệt theo Hình 7.
Hình 10. Chu trình nhiệt PCR
(*Nguồn: Phòng Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, 2013)
− Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,0 % trong dịch đệm 1X TAE (gồm 40mM Tris–OH, 20mM acetic acid và 1mM EDTA), bổ sung Ethidium bromide (0,5 μg/mL) với sự hiện diện của thang chuẩn 1 kb tại 90V trong 40 phút.
− Sau khi được xác định bằng phương pháp PCR, mẫu được gửi giải trình tự tại công ty TBR (Thành phố Hồ Chí Minh). Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự các dòng vi khuẩn trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng công cụ Nucleotide BLAST.
3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của mật số chủng vi khuẩn acid lactic đến quá trình lên men bột chua
Mục đích: Xác định mật độ LAB chủng thích hợp cho quá trình lên men bột chua.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 1 nhân tố, 3 lần lặp lại. Nhân tố mật số chủng của LAB gồm 3 mức độ: 105, 107 và 109 tb/mL bột chua. Thí nghiệm sử dụng 2 mẫu đối chứng không chủng LAB gồm 1 mẫu không được điều chỉnh lượng acid và và 1 mẫu được điều chỉnh độ pH đến giá trị pH cao nhất của các mẫu còn lại. Tổng cộng có (3 x 3) + 2 = 11 đơn vị thí nghiệm.
95°C 95°C Nhiệt độ 5 phút 1 phút 53°C 30 giây 72°C 90 giây 72°C 5 phút 10°C ∞ 30 chu kì Thời gian
Phương pháp thực hiện:
− Chủng chủng LAB đã được định danh vào bình tam giác theo các mật số như bố trí, mỗi bình chứa 40 g bột mì và nước ấm (khoảng 60°C), DY = 300.
− Ủ bình ở 37ºC trong 4 giờ.
− Sử dụng bột chua để làm bánh mì theo quy trình trong Hình 9.
Chỉ tiêu theo dõi:
− pH và TA của bột chua ở 0 và 4 giờ. − pH và TA của bánh mì sau khi nướng. − Tỷ số thể tích/ trọng lượng của bánh.
− Đánh giá cảm quan của sản phẩm bánh mì bột chua (Phụ lục 2: Bảng 10).
3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ủ đến quá trình lên men bột chua
Mục đích: So sánh chất lượng của bột chua và bánh mì bột chua làm ra với thời gian và nhiệt độ ủ bột chua khác nhau để tìm ra điều kiện ủ thích hợp cho bột chua.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 nhân tố, 3 lần lặp lại. Trong đó:
− Nhân tố thời gian ủ gồm 3 mức độ (giờ): 2, 4 và 6.
− Nhân tố nhiệt độ ủ gồm 3 mức độ: 37ºC, 40ºC và nhiệt độ phòng.
Thí nghiệm không sử dụng mẫu đối chứng. Tổng cộng có 3 x 3 =27 đơn vị thí nghiệm.
Phương pháp thực hiện:
− Sử dụng các điều kiện về chủng vi khuẩn và mật số chủng rút ra từ các thí nghiệm trước.
− Bột chua được lên men trong các bình tam giác chứa 40g bột mì, DY = 300. − Ủ bình ở các mức nhiệt độ và thời gian đã nêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
− pH và TA của bột chua ở sau mỗi 2 giờ. − pH và TA của bánh mì sau khi nướng. − Tỷ số thể tích/ trọng lượng của bánh.
− Đánh giá cảm quan của sản phẩm bánh mì bột chua (Phụ lục 2: Bảng 10).
3.2.7. Đánh giá khả năng bảo quản của sản phẩm bánh mì bột chua
Mục đích: So sánh chất lượng của bánh mì bột chua, bánh mì chỉ làm từ nấm men và sản phẩm bánh mì bán trên thị trường.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 1 nhân tố, 3 lần lặp lại. Nhân tố loại bánh mì gồm 4 loại: bánh mì bột chua, bánh mì chỉ làm từ nấm men, và 2 mẫu bánh mì sản xuất cùng ngày mua tại tiệm bánh Sài Gòn và Thuận Tiến thuộc quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ. Tổng cộng có 4 x 3 = 12 đơn vị thí nghiệm.
Phương pháp thực hiện:
− Mẫu bánh mì bột chua: Chuẩn bị bột chua với các điều kiện về mật độ chủng của LAB, nhiệt độ và thời gian ủ thích hợp được rút ra ở các thí nghiệm trước. Sử dụng bột chua để làm bánh mì theo quy trình như Hình 9.
− Mẫu bánh mì chỉ làm từ nấm men: Quy trình làm bánh giống như bánh mì bột chua (Hình 9). Thành phần bột chua được thay bằng hỗn hợp 1 bột mì: 2 nước.
− Mẫu bánh mì trên thị trường: Bánh mì sau khi mua về sẽ được cắt thành lát mỏng dày 2 cm, bảo quản bánh ở nhiệt độ phòng.
− Các mẫu bánh mì sau khi được chuẩn bị sẽ được cắt thành lát bề dày 2 cm, bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 14 ngày.