4.5.1. Kết quả PCR
Hình 9. Kết quả PCR bằng cặp mồi ITS1-4 của 4 dòng nấm men
* Ghi chú: Giếng 1: thang chuẩn 100bp; Giếng 6: D7; Giếng 8: D9; Giếng 10: D11; Giếng 11: D12;
Các dòng nấm men đã lựa chọn để khảo sát lên men đều được chọn để dịnh danh xác định tên loài thông qua phương pháp PCR và giải trình tự vì cho thấy khả năng lên men tốt môi trường chứa bã mía trong điều kiện thí nghiệm. Sau khi PCR, phổ điện di vùng ITS trong khoảng 530-540bp và có chất lượng tốt với duy nhất một băng cho mỗi dòng nấm men (hình 9).
4.5.2. Kết quả giảt rình tự và định danh nấm men
Sau giải trình tự các mẫu DNA của các dòng D7, D9, D11, D12 và tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLASTN, có thể xác định được các dòng nấm men thuộc các loài
Candida inconspicua strain Z-HS62 (D9), Pichia kudriavzevii strain TR (D7) và Pichia kudriavzevii strain TY11 (D11 và D12).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 26 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Hình 10. Kết quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D7
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 27 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Trình tự của dòng D11
Hình 12. quả tra cứu dữ liệu trên NCBI với công cụ BLAST của dòng nấm men D11
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 28 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
CHƯƠNG 5. KẾT LUÂN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Phân lập được 16 dòng nấm men từ các nguồn men rượu với hình dạng tế bào chủ yếu: elip, oval và có kích thước tế bào 1-2 x 2-5µm. Sau khi kiểm tra hoạt tính enzyme (endo- và exoglucanase) và lên men với bốn loại đường các dòng nấm men đa số có hoạt tính exoglucanase và lên men được đường glucose và mannose. Dựa trên đó bốn dòng nấm men đã được lựa chọn (D7, D9, D11, D12) để đánh giá khả năng lên men bã mía và kết hợp lên men với vi khuẩn sinh cellulase.
- Dòng nấm men D11 có kết quả tốt nhất với độ cồn đạt 3,333 % tương đương với 1,323 g/l ethanol, lượng đường khử còn lại đạt 0,549 g/l, DM và CF giảm lần lượt 13,43 % và 46,63 %.
5.2. Đê nghị
- Cải tiến điều kiện xử lý bã mía để có kết quả lên men tốt hơn và nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất ethnol từ bã mía.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của nấm men như: độ acid, độ cồn, nguồn carbon, pH, nhiệt độ,...
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 29 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2009. Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên sâu.
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, trang 3-8.
Đỗ Thị Cẩm Hường. 2012. Phân lập, tuyển chọn và định danh vi khuẩn dạ cỏ bò để thủy phân bã mía trong điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ khoa học Công nghệ sinh học, trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Đức Lượng. 2004. Công nghệ vi sinh vật. Tập 1 : Cơ sở vi sinh vật công nghiệp. Nxb đại học Quốc gia Tp. HCM.
Nguyễn Xuân Bình. 2010. Nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu giàu cellulose. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ chuyên ngành Hóa học, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Xuân Cự. 2010. Nghiên cứu khả năng thủy phân bằng acid loãng và bước đầu
đánh giá hiệu quả sản xuất ethanol sinh học từ thân cây ngô. Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 26 (2010), 211-216.
Tài liệu tiếng Anh
Aristidou, A. and Penttila M. 2000. Metabolicengineeringapplications to renewable resource utilization. Curr Opin Biotechnol. pp.187–198 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Anuj, K.C. 2007. Detoxification of sugarcane bagasse hydrolysate improves ethanol production by Candida shehatae NCIM 350. In the Bioresour Technol. pp.1947– 1950
Badal, C.S. 2003. Hemicellulose bioconversion. In the J Ind Microbiol Biotechnol
(2003) 30. pp.279-291.
Badger, P.C. 2002. Trends in new crops and new uses, Ethanol from cellulose: A general review. pp.17-21.
Bethany, A.C. 2008. Cellulosic ethanol from sugarcane bagasse using rumen microorganisms. In the An ASABE Meeting Presentation. pp.85-148.
Berg¸ J.M., Tymoczko, L. John, Stryer and Lubert. 2002. Biotechnology for Fuels and Chemical. Appl Biochem and Biotechnol, Biochemistry, Spinger. pp.NA
Bhat, M.K. 1997. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications. Biotechnol Adv, 15:583-620.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 30 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Cheng S. G., Li-fu C., Michael C., Flickinger, Ling C.C. and Grorge T.T. 1981. Production of Ethanol from D-Xylose by Using Isomerase and Yeasts. Appl and Environ microbiol. pp. 430-436.
Fatma and Fadel. 2010. Production of Bioethanol Via Enzymatic Saccharification of Rice Straw by Cellulase Produced by Trichoderma reesei Under Solid State Fermentation. New York Sci J., 3(4):72-78.
Hao Z., Haizhen M.and Haijuan N. 2011. Bioconversion of cellulose to bioalcohol. In the Adv in Biomedical Eng Vols. 1-2. pp.254-247.
Harju, S., Fedosyuk H., Peterson K.R. 2004. Rapid isolation of yeast genomic DNA: Bust n' Grab. BMC Biotechnol. PMID: 15102338
James, K. and John K.L. 2001. Wheat straw for ethanol, production in Washington. A resource, technical and economic asessment. pp. 18.
Jeewon, L. 1997. Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol.
J Bioethanol 56:1-24.
Jeffries, T.W. and Jin Y.S. 1999. Ethanol and thermotolerance in the bioconversion of xylose by yeast. Adv Appl Microbiol (47). pp.221-268.
Lehninger. Principles of biochemistry. pp.535-540.
Manjusha, D. and Rajyalakshmi K. 2012. Production and partial characterization of β- Glucanase from Galactomyces sp. isolated from whey. In the Elixir Bio Tech. 53 (2012). pp. 11932-11936.
Mario, G.M. 2007. Ras-pathway has a dual role in yeast galactose metabolism. In the
FEBS Letters. Volume 581, issue 10, pp. 2009-2016.
Marina, O.S. D and Adriano V.E. 2009. Production of bioethanol and other bio-based materials from sugarcane bagasse: Integration to conventional bioethanol production process. In the Chemical engineering research and design 87 ( 2009). pp.1206-1216.
Nasim, S., Saba G., Mohammad R.A. and Soheila Y. 2011. Ethanol production from sugarcane bagasse by means of enzymes produced by solid state fermentation method. In the World Academy of Science, Eng and Technol 59 (2011). pp.1836- 1839.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến 31 Viện NC&PT Công Nghệ Sinh Học
Reeta, R.S. 2013. Role of significance of beta-glucosidases in the hydrolysis of cellulose for bioethanol production. Bioresour Technol. 127(2013). pp. 500-507. Rosalin and Emit N. 2007. Production of ethanol from bagasse. Yan lin, Shuzo Tanaka.
2005. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. In the Appl Microbiol Biotechnol (2006) 69. pp.627-642.
Sun, Y. and Cheng J. 2002. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review. Bioresour Technol. 83. pp. 1-11.
Xiushan Y. 2011. Ethanol production from the enzymatic hydrolysis of non-detoxified steam-exploded corn stalk. Bioresour Technol. 102 (2011). pp.7840-7844.
White, T.J., Bruns T, Lee S, Taylor J .1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: a guide to methods and applications. (Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ, eds). Academic Press, New York, USA. pp.315–322.
Trang web: http://genomicscience.energy.gov/centers/index.shtml (ngày 13/09/2013). http://online.wsj.com/article/SB10001424052970204012004577072470158115782.html (ngày 13/09/2013) http://suigenerisbrewing.blogspot.com/2013/04/identifying-yeasts-using-ribosomal.html (ngày 13/09/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/M%C3%ADa (ngày 13/09/2013) http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/nammen01.html (ngày 26/11/2011) http://wiki.bugwood.org/Distinguishing_fungi_by_ITS_sequencing(ngày 13/09/2013) http://www.biofuelstp.eu/cell_ethanol.html (ngày 13/09/2013) http://www.cifor.org/bioenergy/_ref/research/output/published-document.htm (ngày 13/09/2013) http://www.energyfuturecoalition.org/biofuels/fact_ethanol_cellulose.htm (ngày 13/09/2013) http://www.fao.org/docrep/003/s8850e/s8850e03.htm (ngày 11/12/2013) http://www.scribd.com/doc/27317644/Cellulosic-Ethanol-Report (ngày 13/09/2013) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (ngày 11/12/2013)
PHỤ LỤC (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
PHỤ LỤC 1. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG THÍ NGHIỆM
PHỤ LỤC 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
2.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm tế bào nấm men 2.1.1. Quan sát khuẩn lạc nấm men
Sử dụng que cấy lấy tế bào nấm men từ ống trữ cho vào 1ml nước cất, tiến hành vortex để nấm men phân bố đều. Sau đó lấy 5μl nhỏ lên đĩa petri có chứa môi trường PGA, ủ ở 38oC, 24 - 48 giờ rồi tiến hành khảo sát: hình dạng, kích thước, màu sắc, độ nổi, dạng bìa của khuẩn lạc.
+ Hình dạng: dạng tròn có kích thước nhỏ (punctiform) và lớn (circular); dạng không đều (irregular), dạng thoi (spindle), rễ cây dạng sợi (filamentous) và rễ (rhizoid).
+ Độ nổi: dạng phẳng (flat) thường thấp và ngang với mặt môi trường; dạng lài (raised) có chiều cao khuẩn lạc khá hơn dạng phẳng nhưng có 2 dốc (phía vành khuẩn lạc lài xuống); dạng mô (convex) thường mổi mô cao lên trên môi trường đặc; dạng nổi cầu chồng do nhiều khuẩn lạc có độ nổi phát triển chồng lên nhau và có dạng như nổi gò (pulvinat), nổi bướu (unbonate), nổi hố (umbilicate).
+ Dạng bìa: có 5 dạng phổ biến là bìa nguyên (entire), bìa gợn sóng (curled), bìa chia thùy (lobate), bìa răng cưa (erose).
+ Màu sắc: khuẩn lạc thường có màu trắng, trắng đục, trắng sữa,…
(*Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)
2.1.2. Quan sát tế bào nấm men
Chuẩn bị mẫu nấm men. Nhỏ 20μl nước cất vô trùng lên kính mang vật. Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. Lấy một ít khuẩn lạc rồi trãi đều lên giọt nước trên kính mang vật. Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45O rồi đậy kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí. Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học để thấy được hình dạng tế bào.
2.2. Phương pháp đếm mật số nấm men bằng buồng đếm hồng cầu
Phương pháp đơn giản nhất để xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới kính hiển vi. Tế bào nấm men được xác định bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Burk-Turk với nồng độ pha loãng thích hợp
Sau khi đếm số tế bào trên buồng đếm, số tế bào/ml được tính theo công thức: N=[a/0.016]x103xn(tb/ml)
Trong đó: N: số lượng tế bào trong 1ml a: tổng số tế bào trong 4 ô lớn 0.016: thể tích của 4 ô lớn (µl)
103: số chuyển mm3 thành ml ( 1000 mm3 = 1ml) n: độ pha loãng
Hoặc: N=[(a/b) x (256/0.1)] x 103 xn
Trong đó: N: số lượng tế bào trong 1ml a: tổng số tế bào trong 4 ô lớn
b: số ô vuông nhỏ trong 4 ô vuông lớn (16x4 = 64 ô vuông nhỏ); 256: tổng số ô vuông nhỏ trong ô trung tâm.
103: số chuyển mm3 thành ml ( 1000 mm3 = 1ml) n: độ pha loãng
2.3. Phương pháp phân tích xơ (AOAC, 1993) 2.3.1. Hàm lượng vật chất khô ( DM ) của bã mía
Nguyên tắc : Sấy khô mẫu ở 105oC cho lượng nước mất đi, phần còn lại là chất khô hoàn toàn của mẫu
Tiến hành :
Sấy 2 gram bột bã mía được sấy ở 105oC trong 2 giờ. Lấy mẫu ra cân cà tiếp tục sấy mẫu thêm khoảng 2 giờ rồi đen cân lại đến khi trọng lượng giữa 2 lần không chênh lệch. Vật chất khô được tính theo công thức : X= m1*100/m0
Trong đó :
m1 : khối lượng mẫu sau khi sấy 105oC (g) m0 : khối lượng mẫu đem phân tích (g)
X : phần trăm vật chất khô có trong bã mía (%)
2.3.2. Hàm lượng xơ thô tổng số theo phương pháp Proximate
Bột bã mía nghiền mịn được đun sôi hoàn lưu trong 30 phút với dung dịch H2SO4 1,25 %.và NaOH 1,25% sau đó lọc và đem sấy ở 70oC trong 2 ngày. Cân trọng lượng không đổi sau khi sấy. Vật chất khô được tính theo công thức: X= m1*100/m0
Trong đó : (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
m1 : khối lượng mẫu sau khi sấy 70oC (g) m0 : khối lượng mẫu đem phân tích (g)
2.4. Phương pháp xác định lượng đường khử (Nelson)
- Dựng đường chuẩn: Chuẩn bị dãy nồng độ Glucose chuẩn từ 0-1 mM. Cho 150μl dung dịch đường vào tuýp 1,5 ml. Thêm 150μl thuốc thử đồng. Đun cách thủy 100oC trong 10 phút. Để nguội, thêm 150μl thuốc thử Arseno-molybdate và 1 ml nước cất. Ủ 20 phút và đo OD ở bước sóng 520 nm.
- Chuẩn bị mẫu: Chuẩn bị tương tự với đường chuẩn. Thay dung dịch đường glucose bằng dịch mẫu thí nghiệm. Có thể pha loãng mẫu tùy điều kiện.
Kết quả dựng đường chuẩn Glucose
Hình 65. Biểu đồ đường chuẩn Glucose
2.5. Phương pháp xác định lượng ethanol bằng cách chuẩn độ với K2Cr2O7
Hóa chất: Na2S2O3 0,1 M, K2Cr2O7 0,05 M, H2SO4 50%, KI 0,5 M, tinh bột 1%.
Thực hiện:
- Chuẩn bị mẫu blank: Nước cất dùng làm mẫu thử không đển phản ứng vớ K2Cr2O7 0,05 M trong môi trường có H2SO4; và KI; sau đó Na2S2O3 0,1 M được dùng để chuẩn độ cho đến khi màu xanh lơ có dùng tinh bột để chỉ thị màu.
- Chuẩn bị mẫu thật: Tương tự với mẫu blank. Thay nước cất bằng dung dịch cần chuẩn độ.
- Tính toán kết quả:
2Cr2O72- + 16H+ + 3C2H5OH 4Cr3+ + 11H2O + 3CH3COOH Cr2O72- + 14 H+ +6I- 2Cr3+ + 3I2 + 7H2O
2S2O32- + I2 S4O62- + 2I-
2.6. Quy trình trích ly DNA nấm men (Harju, 2004)
- Chuyển 1,5 ml dịch nuôi nấm men trong môi trường YDP sau 20-24 giờ ở 30oC vào tuýp ly tâm. Ly tâm với tốc độ 20.000 x g trong 1-5 phút.
- Thêm 200 l dung dịch đệm Harju (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) và 1 mM EDTA)
- Để tuýp vào trong đá lạnh trong 2 phút.
- Ủ 95oC trong water bath trong 1 phút. Lặp lại hai bước trên. Vortex 30 giây. - Thêm 200 l chloroform và vortex 2 phút.
- Ly tâm 20.000 x g ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
- Chuyển phần dịch trong phía trên sang tuýp mới có chứa 400 l ethanol lạnh. Trộn đều bằng máy vortex vả ủ ở -20oC.
- Ly tâm 20.000 x g ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.
- Hút bỏ phần dịch phía trên. Rửa phần cặn với 0,5 ml 70% ethanol. - Ly tâm 20.000 x g ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Bỏ phần dịch trên.
- Để khô ở nhiệt độ phòng hoặc trong máy làm khô chân không ở 60oC trong 5 phút. - Hòa tan lại với 25- 50 l dung dich TE (pH 8,0). Kiểm tra độ tinh sạch và trữ lạnh -20oC cho phản ứng PCR và điện di.
PHỤ LỤC 3. SỐ LIỆU THÍ NGHIỆM
Bảng 6. Đường kính phân giãi CMC và bã mía của các dòng nấm men
Ký hiệu dòng nấm men CMC BM D1 3,833 9,333 D2 2,667 12,667 D3 2,000 10,833 D4 7,500 11,000 D5 4,667 12,000 D6 3,667 12,667 D7 5,500 12,500 D8 2,000 9,500 D9 9,500 13,333 D10 2,833 11,667 D11 4,667 13,000 D12 5,500 13,333 D13 8,500 12,333 D14 2,000 0,000 D15 3,167 15,333 D16 3,000 6,1667 CV (%) 7,628 6,166
*Ghi chú: CMC: carboxylmethyl cellulose; BM: bã mía chưa xử lý. Giá trị trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại.
Bảng 7. Chiều cao cột khí (mm) sinh ra sau các khoảng thời gian lên men (giờ) với đường Glucose và Mannose của các dòng nấm men
Ký hiệu dòng nấm men GLUCOSE MANNOSE 24 36 48 60 24 36 48 60 D1 0,7 5,3 6,7 17,33 1,3 12,3 14,7 24,33 D2 0,0 1,3 2,3 15,67 0,7 12,3 16,7 24,33 D3 0,5 3,0 5,3 23,33 1,7 17,3 19,3 25,00 D4 0,5 3,0 6,0 19,33 0,7 9,0 11,7 25,00 D5 0,0 2,3 3,3 19,00 1,2 6,0 7,0 22,00 D6 0,3 1,7 3,0 16,67 1,2 4,3 5,7 16,00 D7 0,7 5,3 7,3 24,33 0,7 10,3 13,7 24,33 D8 1,3 5,3 8,7 23,33 2,0 11,7 14,0 24,33 D9 0,3 6,0 8,0 25,00 1,3 7,3 9,3 23,67 D10 0,5 5,7 6,0 22,67 0,7 9,7 14,0 23,67 D11 1,0 6,0 10,0 23,67 0,8 8,0 10,7 24,67 D12 0,3 5,0 9,0 23,00 1,8 16,7 21,3 24,67 D13 0,0 0,0 0,3 7,67 0,2 0,7 2,3 9,33 D14 0,5 3,0 5,3 21,67 0,7 9,3 12,3 22,67 D15 0,0 0,0 0,0 3,00 0,0 0,0 0,0 4,00 D16 0,8 7,0 9,7 21,00 2,0 10,7 14,0 23,33 CV (%) 4,46 4,30 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 8. Thể tích cột khí (ml) sinh ra sau 7 ngày lên men của các dòng nấm men
Nghiệm thức Thể tích khí sinh ra sau các khoảng thời gian (ngày)
1 2 3 4 5 6 7 NT1 13,00 38,00 41,33 44,67 45,00 46,33 48,00 NT 2 0,00 0,67 5,33 20,00 22,33 23,00 23,00 NT 3 3,00 8,33 12,00 12,67 13,33 13,67 14,00 NT 4 16,67 45,33 52,67 54,67 59,00 60,00 60,33 NT 5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,17 0,33 0,50 NT 6 2,00 3,00 3,83 4,00 4,33 5,00 5,50