Cân chính xác một lượng bột kháng sinh đã tinh chế và một lượng bột kháng sinh thô hòa tan trong methanol với tỷ lệ ngang nhau. So sánh hoạt tính kháng sinh của hai dịch ứiu được bằng phương pháp khoanh giấy lọc và
Bảng 17: Hoạt tính kháng sinh của bột KS đã tinh chế và bột KS thô. \K e t quả Hoạt tính B. pumỉlus p. mỉrabỉlỉs Mầu Đ(mm) s %biên đổi hoạt tính D(mm) s %biên đổi hoạt tính BộtKS (l)tinh/methanol 23,64 0,56 117,61 2 2 , 0 0 0,51 115,91 BộtKS (2)tinh/methanol 22,85 0,80 113,68 21,72 0,37 114,98 BộtKS thô/methanol 2 0 , 1 0 0,67 1 0 0 , 0 0 18,89 0,23 1 0 0 , 0 0
Bảng 18: Kết quả SKLM của bột KS thô và KS (1) tinh / methanol (thử với
B. pumilus).
Kết
Bột KS (1) tinh / methanol Bột KS thô/ methanol
Rf ^ 0,93 0,93
Nhận xét: hoạt tính của bột KS đã tinh chế có thay đổi so với bột KS thô, cho thấy bột KS tinh chế là tinh khiết hoĩi bột ứiô.
Thành phần bột KS đã tinh chế không ứiay đổi, bột KS này là tinh khiết sắc ký.
2.2.10. Kết quả thử khả năng chống nấm.
Để thử tác dụng chống nấm của kháng sinh do Streptomyces 16.34 tạo
ra, chúng tôi sử dụng dịch chiết n-buthanol (tại pH =3), dịch nước loại, dịch lọc methanol để thử hoạt tính bằng phương pháp khuyếch tán sử dụng khối
thạch và khoanh giấy lọc. Thử với c. aỉbicanSị mốc xanh sp. 1, A. nỉger. Kết
Bảng 19: Kết quả thử khả năng chống nấm của chủng Streptomyces 16.34.
Mau thử
Kêt quả
STT c. albicans A. niger Môc xanh sp. 1
D(mm) s D(mm) s D(mm) s 1 (CM ng 1634)' 15,60 0,32 15,96 0,36 13,90 1 , 2 2 Dịch lọc nước 13,80 1 , 1 0 11,61 1 , 1 1 17,70 0,56 3 Dịch n-butanol (pH3) 0,00 0 0,00 0 0,00 0 4 Nước loại 0,00 0 0,00 0 0,00 0 5 Dịch lọc methanol 13,47 1 , 2 0 13,36 0,73 12,34 0,90 ĩ
Nhận x é t : Kháng sinh do chủng Sữeptomyces 16.34 tạo ra có tác dụng chống nấm rõ rệt.
Dịch chiết n-butanol (dịch chiết có hoạt tính với vi khuẩn), pha nước loại (sau chiết bằng n-butanol tại pH =3) không có tác dụng chống nấm. Do vậy có thể sơ bộ kết luận hoặc thành phần có tác dụng chống nấm đã bị n-
buthanol phá hủy, và có nhiều khả năng đây là một chất khác do Streptomyces
i ố. 3^ tổng hợp ra.
Dịch lọc methanol có hoạt tính chống nấm. Do vậy chúng tôi sử dụng dịch lọc này cho các nghiên cứu tiếp theo về khả năng chống nấm của chủng
Streptomyces 16.34.
2.2.11. Kết quả sắc ký kháng sinh chống nấm
Dịch lọc methanol sau khi cất chân không thu bột thô, cân 10 mg bột KS thô hòa tan vào 10 ml methanol, tiến hành SKLM bột này trên một số hệ dung
môi, chúng tôi nhận thấy hệ dung môi 1 ( Cloroform : methanol : NH4OH
này tiến hành sắc ký trên cột, sử dụng hệ dung môi 1, chúng tôi thu được 8
phân đoạn phản hấp phụ. Thử hoạt tính của 8 phân đoạn này bằng phưoTig
pháp khoanh giấy lọc với A. nỉger, kết quả được trình bày ở bảng 20:
Bảng 20: Hoạt tính chống ĩ\ầmA. nỉger của 8 phân đoạn
Kết quả Hoạt tính Phân đoạn £)(mm) s 1 0 , 0 0 0 , 0 0 2 10,62 0,75 3 15,21 0,44 4 0 , 0 0 0 , 0 0 5 0 , 0 0 0 , 0 0 6 0 , 0 0 0 , 0 0 7 0 , 0 0 0 , 0 0 8 0 , 0 0 0 , 0 0
Nhận xét: Các phân đoạn 2, 3 có khả năng chống nấm, được giữ lại cho các nghiên cứu tiếp theo.
PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 3.1. KẾT LUẬN
Sau thời gian nghiên cứu chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề ra và thu được các kết quả sau:
- Tiến hành sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến cải tạo giống qua 2 thế hệ đã chọn được một số biến chủng có hoạt tính cao hơn so với chủng ban đầu.
r Trong các môi trường khảo sát, môi trường MT4 dd là môi trường lên
men chìm tốt nhất cho chủng Streptomyces 16.34 sinh tổng hợp kháng sinh.
- Tiến hành chiết và sắc ký lóp mỏng với một số hệ dung môi, kết quả cho ứiấy có ít nhất 3 ửiành phần kháng sinh có hoạt túih với vi khuẩn và vi nấm.
- Thành phần có hoạt tính với vi khuẩn có thể chiết hoàn toàn bằng n- butanol tại pH=3.
- Thành phần có hoạt tính với vi nấm không thể chiết được n-butanol, nhưng có thể thu nhận được từ môi trường nuôi cấy bề mặt sử dụng methanol
- Kháng sinh do Sữeptomyces 16.34 sinh tổng họp có tìiể tách và tinh chế
bằng phương pháp sắc ký ừên cột với chất hấp phụ là Silicagel 60 F245, Merck.
3.2. ĐÈ XUẤT
- Tiếp tục nghiên cứu đột biến bằng ánh sáng u v nhằm tạo ra được nhiều chủng đột biến dưong cao, tăng khả năng sinh tổng hợp kháng sinh.
- Tiếp tục nghiên cứu các điều kiện lên men để nâng cao hiệu suất lên men.
- Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quá trình chiết tách và tinh chế kháng sinh tinh khiết.
- Tiếp tục nghiên cứu, chiết tách thành phần có hoạt tính chống nấm.
- Tiếp tục phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối để có ứiể xác định cấu trúc hóa học, các đặc túih hóa, lý, của kháng sinh ứiu được.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I]. Bộ môn Dược Lý (2004), Dược lý học, Trường Đại Học Dược Hà Nội,
tập2,tr. 112-130.
[2]. Bộ môn Hóa Phân Tích (2002), Hỏa phân tích, Trưòng Đại Học Dược Hà
Nội, tập 2, tr. 43-98.
[3]. Bộ môn Công Nghiệp Dược (2003), Kỹ thuật sản xuất dược phẩm,
Trường Đại Học Dược Hà Nội, tập 1, tr. 142-164.
[4]. Bộ môn Hóa Phân Tích (2004), Kiểm nghiệm thuốc, Trường Đại Học
DượcHàNội,tr.l03-128.
5]. Bộ môn Vi sinh và Sinh học (2005), Vi sinh vật học, Trường Đại Học
Dược Hà Nội, tr 3-30; tr. 37-47; tr. 73-89.
6]. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB
Khoa học và Kỹ thuật, tr. 9-23.
7]. Hoàng Thị Hồng cẩm (2006), Góp phần nghiên cứu sinh tổng hợp kháng
sinh từ Sừ'eptomyces 21.123, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại Học Dược Hà Nội.
’8]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh
vật học, NXB Giáo dục, tr. 38-41.
9]. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học và sản xuất dược
phẩm, NXB Y học, tr. 42-54.
[10]. Lê Đình Lưong, Phan Cự Nhân (2003), Cơ sở di truyền học, NXB Giáo
dục, tr.40-49.
II]. Lê Xuân Phương (2001), Vỉ sinh vật công nghiệp, NXB Xây dựng, tr.
[12]. Huỳnh Thu Trang ( 2002), Góp phần nghiên cứu khảng sinh từ chủng Sừ-eptomyces 315, Khóa luận tốt nghiệp Dược sỹ đại học, Trường Đại Học Dược Hà Nội.
[13]. Motoo Kobayashi, Seiji Yoshimura, Takayoshi Kinoshita, Michizane Hashimoto, Seiji Hashimoto, Shigehiro Takase, Akihiko Fujie, Motohiro Hino, and Yasuhiro Hori (2005), “FR207944, an Antifiingal Antibiotic from
Chaetomium sp. No.217. Il.Isolation and Structure Elucidation”, Bioscience,
Biotechnologyl, and Biochemistry, Vol 69, p. 1029-1032.
[14]. Kobayashi, M., Kanasaki, R., Sato, L, Abe, F., Nitta, K., Ezaki, M., Sakamoto, K., Hasimoto, M,, Fujie, A., Hino and et al (2005) “FR207944, an Antifimgal antibiotic from Chaetomium sp. No. 217. I. Taxonomy,
frmentation and biological prperties”, Bioscience, Biotechnology, and
Biochemistry, Vol 69, p.515-521.
15]. Shigematus, N., Tsujii, E., Kayakiri, N., Takase, s., Tanaka, H., and Tada (1992) “WFl 1605, an antagonist of leukotriene B4 produce by a fungus.
II. Structure determination”, J. Antibiotics, Vol 45, p.704-708.
[16]. Andre A. Neves, Luis M. Vieria and Jose c . Menzes (2001), “Effect of
Perculture variabilyti on clavunalic and Permentation”, Biotechnology and
Bioengineering, Vol 72, p.628-632.
17]. Johanes A. Roubos, Perben Krabben, w T.A.M. de Laat, Robert Babuska and Joseph J. Heijnen (2002), “Clavunalic acid degradation in
Sú’eptomyces clavuligerus — Batch cultivations”, Biotechnologyl, Progress,
Phần phụ lục
Hình p. 1: Hoạt tính kháng sinh của các dạng chủng chọn lọc tự nhiên (vi khuẩn kiểm định là Bacillus pumilus).
Hình P.2: Hoạt tính kháng sinh của các biến chủng sau đột biến lần 1 (vi khuẩn kiểm định là Bacillus pumilus).
Hình P.3: Kết quả SKLM dịch chiết n-butanol vói hệ dung môi 1 ( VI khuân kiêm định là Bacillus pumilus).
Hưứi R4: Hoạt tính kháng sũih của các phân đoạn 5 4 3 2 1 (vi
Hình P.5: Hoạt túứi kháng sinh của các phân đoạn 6, 7, 8, 9, 10, ( vi khuẩn kiểm định là B. pumilus).
% ;v ^
i S l S
Hình R6: Kết quả SKLM bột KS (1) tinh/methanol (vi khuẩn
Hình R7: Hoạt túứi chống nấm của chủng Streptomyces 16.34(1), dịch chiết n-butanol (2), dịch lọc nước (3), pha nước loại(4, tại
pH chiết =3), (vi nấm kiểm định là mốc xanh sp.l).
Hình R8: Hoạt tứứi chống nấm của dịch chiết n-butanol(l) (tại pH
Hình RẴ; Máy lắc lên men Bio Shaker BR 300 LF P-9
Hình FV9: Nồi hấp vô trùng Hirayama P-40