Trạng thái môi trường, pH, nhiệt độ, ánh sáng, là những yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan và hình thái của mô, tế bào thực vật.
Trạng thái môi trường:
Môi trường đặc: Được bổ sung 8 - 10% agar. Agar có độ ngậm nước cao, khả năng di đông tốt, nhiệt đô nóng chảy là 80oC, nhiệt độ đông đặc là 40oC.
Môi trường lỏng: Sử dụng cho các mục đích nuôi cấy khác nhau, môi trường nhân nhanh, nuôi cấy protoplast, dung dịch nuôi cấy huyền phù...
pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào. pH của môi trường nuôi cấy thích hợp cho đa số các loại cây trồng dao động từ 5,5 - 6,0. Nếu pH thấp thì agar sẽ không đông sau khi hấp khử trùng. Khi pH < 4 hoặc pH >7 thì sẽ làm kết tủa một số muối vô cơ và phân giải một số chất hữu cơ sẽ làm chết cây.
Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng như: cường độ chiếu sáng, chu kỳ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng.
Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng phù hợp nằm trong khoảng 2000 - 2500 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao hơn để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng, có khả năng quang hợp. Kết quả nghiên cứu của Vince-Pure (1994) [121], Teresa và cs (2007) [116], đã chỉ ra nguồn ánh sáng và cường độ ánh sáng có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và chất lượng cây giống.
Để mô cấy phát triển tốt thì phòng nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25 - 280C [17].
1.2.4. Đặc điểm thời tiết khí hậu Thừa Thiên Huế và miền Trung Việt Nam
Thừa Thiên Huế là một tỉnh thuộc miền Trung Việt Nam, là vùng giao thoa giữa hai miền Nam Bắc (150 59’ 30’’- 160 44’ 30’’ độ vĩ Bắc), nên có chế độ bức xạ phong phú, đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm và được chia thành hai mùa rõ rệt trong năm.
Mùa mưa bắt đầu từ tháng IX đến XII, trùng với mùa bão, lượng mưa lớn (2.800 - 2.900 mm) chiếm 60 - 70% tổng lượng mưa trong năm, nhưng phân bố không đều giữa các tháng. Sự chênh lệch nhiệt độ giữa các tháng mùa Đông lớn hơn giữa các tháng mùa Hè. Từ tháng III đến tháng VI nhiệt độ tăng rất nhanh, tháng XI đến tháng XII nhiệt độ giảm mạnh, do có sự kết hợp với gió mùa Đông Bắc lạnh. Sự chênh lệch nhiệt độ trung bình giữa các tháng trong năm không quá cao. Biên độ nhiệt của năm dao động trong khoảng 9 - 10oC (phụ lục 1).
Mùa khô, có nền nhiệt độ cao. Nhiệt độ trung bình năm dao động khoảng 24 - 25,2oC, nhiệt độ trung bình tháng I khoảng 20oC thấp nhất trong năm. Trong mùa Hè, tháng VI và tháng VII là 2 tháng nóng nhất, nhiệt độ trung bình dao động trong khoảng 28,2 - 29,4oC, kết hợp với gió mùa Tây Nam khô nóng, lượng mưa nhỏ, thường gây hạn hán. Điều này có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng, phát triển của các loại hoa nói chung và cây hoa chuông nói riêng.
Do đó, để trồng được hoa chuông, cần phải áp dụng một số biện pháp kỹ thuật thích hợp trong quá trình ươm cây giống hoa chuông in vitro và trồng cây hoa chuông thương phẩm như thời vụ ươm trồng, giá thể trồng, chế độ dinh dưỡng hợp lý,… nhằm làm hạn chế những ảnh hưởng bất lợi của điều kiện thời tiết khí hậu, tăng tỷ lệ cây sống, tạo điều kiện thuận lợi cho cây sinh trưởng phát triển tốt, làm tiền đề để tăng năng suất và chất lượng hoa của cây hoa chuông thương phẩm.
1.3. Kỹ thuật ươm, trồng cây hoa chuông và những yếu tố ảnh hưởng1.3.1. Thời vụ 1.3.1. Thời vụ 1.3.1. Thời vụ
Cơ thể và môi trường là một khối thống nhất. Cơ thể thực vật luôn chịu ảnh hưởng của các nhân tố sinh thái: nhiệt độ, ánh sáng, nước, không khí (chủ yếu là CO2 và O2), sâu bệnh hại… để tồn tại, sinh trưởng phát triển và tái tạo nên cơ thể mới. Các nhân tố sinh thái thường thay đổi có tính chất chu kỳ theo ngày (sáng, trưa, chiều, đêm), theo mùa trong năm (Xuân, Hạ, Thu, Đông). Các loài thực vật ở các vùng sinh thái khác nhau, do quá trình chọn lọc tự nhiên lâu đời mà đã có phản ứng thích nghi với các biến đổi có tính chu kỳ đó của các nhân tố sinh thái.
Cây hoa chuông có nguồn gốc nhiệt đới và đa số các giống hoa chuông được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ thích hợp dao động từ 18 - 240C. Cây hoa chuông cần nhiều ánh sáng nhưng không ưa ánh sáng trực xạ. Vì vậy, thời vụ trồng không phù hợp sẽ ảnh hưởng tới sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng hoa của cây hoa chuông.
Để giảm thiểu các tác hại do các điều kiện ngoại cảnh bất thuận cho việc ươm cây giống in vitro và trồng cây hoa chuông thương phẩm, cần xác định được thời vụ ươm trồng phù hợp, để áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác hợp lý…
Đối với từng vùng sinh thái khác nhau, việc bố trí thời vụ trồng phù hợp cho một loại cây trồng cụ thể thường không giống nhau. Xác định thời vụ trồng cần căn cứ vào các điều kiện sau:
- Đặc tính của giống: nguồn gốc của giống, thời gian sinh trưởng của giống, yêu cầu điều kiện sinh thái của giống…
- Điều kiện áp dụng các biện pháp kỹ thuật canh tác. - Tính chất đất.
- Tình hình xuất hiện sâu bệnh hại…
Các biện pháp kỹ thuật tác động sẽ phát huy được hiệu quả trên cơ sở nguồn cây giống có chất lượng tốt và thời vụ trồng phù hợp.
1.3.2. Giá thể trồng
Giá thể là từ dùng để chỉ tất cả các vật chất bao quanh bộ rễ của cây trồng, các loại giá thể khác nhau có ưu nhược điểm khác nhau và tùy theo mục đích trồng, loại cây trồng mà chọn các loại giá thể thích hợp.
Giá thể bao gồm hỗn hợp của các vật liệu có thể giữ nước, tạo độ thoáng cho sự phát triển của cây. Hỗn hợp này được dùng đơn lẻ hoặc phối trộn lại để tận dụng ưu điểm từng loại: bột núi lửa, vỏ trấu hun , mùn dừa, than bùn, đá trân châu, cát, sỏi,... Các loại giá thể này được dùng phổ biến trong ngành khoa học nghề vườn [99].
Giá thể trồng cây có ưu điểm:
- Kiểm soát được pH, thành phần dinh dưỡng, các yếu tố gây bệnh và lây truyền bệnh cho cây.
- Có khả năng giữ ẩm và thoáng khí tốt.
- Có khả năng tái sử dụng hoặc an toàn cho môi trường khi phân hủy.
Cây giống hoa chuông in vitro khi đưa ra trồng ngoài vườn ươm cần loại giá thể giữ ẩm và thoát nước tốt, giúp cây ít bị mất nước trong giai đoạn đầu. Ở giai đoạn vườn sản xuất, do cây có bộ lá lớn, nhiều nụ, hoa, bộ rễ chùm nên giá thể trồng cần chứa nhiều chất hữu cơ mùn làm tăng độ xốp, điều hoà chế độ nước tưới và chế độ nhiệt, giúp ổn định kết cấu các thành phần trong giá thể, tăng khả năng hấp phụ và trao đổi ion làm cho giá thể có khả năng chịu nước, chịu phân cao, tăng tính đệm, đảm bảo cho các phản ứng hoá học và ôxy hoá khử xảy ra bình thường, tạo điều kiện cho cây sinh trưởng phát triển tốt [99].
* Các loại giá thể được sử dụng
• Xơ dừa:Xơ dừa được lấy từ vỏ quả dừa, nghiền nhỏ và có thể làm khô đóng
thành bánh để dễ vận chuyển và bảo quản. Trước khi sử dụng cần loại bỏ chất chát (tanin). Xơ dừa là giá thể có khả năng giữa ẩm và thông thoáng khí tốt nhưng nó dễ gây úng cho một số loại cây trồng, có pH từ 6,5 - 7, có trọng lượng riêng thấp, tính ổn định cao. Xơ dừa có thể sử dụng đơn lẻ hoặc phối trộn với các nguyên liệu khác như than bùn, tro trấu, đất mùn theo tỷ lệ thể tích 1:2; 1:1, sẽ tạo ra loại giá thể có độ tơi xốp cao, thông thoáng khí rất thích hợp để trồng rau hoặc trồng các cây hoa ngắn ngày trong giai đoạn vườn ươm, trồng cây trong nhà kính mà không cần đất [61].
• Trấu hun: Trấu hun là mảnh vỏ lúa (sau khi đã lấy gạo) đem hun cháy
nhưng chưa thành tro. Trấu hun là giá thể hữu cơ, thoát nước tốt, thích hợp với nhiều loại cây trồng. Trong trấu hun chứa một lượng lớn kali có tính kiềm, có thể tái sử dụng và hoàn toàn sạch bệnh. Trấu hun là loại phế phẩm rất phổ biến trong nông nghiệp. Cũng như xơ dừa, sử dụng trấu hun làm giá thể trồng cây mang lại hiệu quả kinh tế cao [101].
• Cát: Đây là loại giá thể trơ điển hình và thường được sử dụng trong các hệ thống mở. Trồng cây trên giá thể cát có lợi là dễ tìm kiếm, rẻ tiền và đơn giản khi sử dụng. Cát tồn tại ở dạng hạt, độ lớn của hạt cát từ 0,1 mm đến 2 mm. Chúng được rửa sạch, khử trùng sấy hay phơi khô trước khi sử dụng [101].
• Đất phù sa và phân chuồng: Là loại nguyên liệu thường được dùng để
phối trộn với các nguyên liệu khác làm giá thể ươm cây. Đất phù sa có chứa nhiều dinh dưỡng nhưng dễ bị dí dẽ khi sử dụng đơn lẻ, cây sinh trưởng kém. Phân chuồng được ủ hoai mục cung cấp chất dinh dưỡng cho cây và góp phần làm tơi xốp giá thể [101].
• Đất Tribat: Đất sinh học Tribat là một thành tựu mới của công ty công nghệ sinh học Sài Gòn Xanh là hỗn hợp hữu cơ gồm có mùn, bột dừa có bổ sung N tổng số, K2O tổng số, P2O5 tổng số, các trung vi lượng gồm Mg, Mn, Zn, Bo, Cu, Mo và các cấp hạt khác nhau. Được sử dụng để trồng các loại rau, hoa, gieo ươm cây con rất có hiệu quả [133].
Giá thể làm giá đỡ cho cây, cung cấp ẩm độ, độ thoáng khí và cải thiện độ pH, đồng thời cung cấp các chất dinh dưỡng để thích hợp với từng đối tượng cây trồng. Theo John và Harold (1999) [61], để tăng hiệu quả sử dụng nên phối trộn các loại giá thể với nhau. Trước đây, người ta dùng các loại vỏ cây, mùn cưa, và vỏ bào trong quá trình chế biến gỗ được dùng trực tiếp để làm giá thể trồng cây nhưng hiệu quả không cao. Ngày này, thay vì sử dụng trực tiếp người ta đã phối trộn và xử lý trước khi sử dụng nên khả năng giữ ẩm tăng, độ thông khí tốt, CEC cao [37].
Năm 1999, John và Harold đã nghiên cứu khả năng giữ ẩm của các loại giá thể hỗn hợp bao gồm: đất, cát, than bùn với tỷ lệ (1:1:1); than bùn, ve cmiculite với tỷ lệ (1:1); và vỏ ngũ cốc, cát, than bùn tỷ lệ (3:1:1). Kết quả nghiên cứu đã xác định được khả năng giữ nước của hỗn hợp than bùn + vecmiculite là tốt nhất, kế đến là hỗn hợp vỏ ngũ cốc + cát + than bùn và kém nhất là hỗn hợp đất + cát + than bùn. Nhưng khi xét tính thông thoáng khí thì hai hỗn hợp giá thể than bùn + vecmiculite và vỏ ngũ cốc + cát + than bùn tương đương nhau, hỗn hợp giá thể đất + cát + than bùn là kém nhất trong 3 loại giá thể thử nghiệm [61].
1.3.3. Phân bón lá
Phân bón lá là hỗn hợp bao gồm các chất dinh dưỡng đa lượng, trung lượng, vi lượng, một số chất điều hòa sinh trưởng và các chất phụ gia hỗ trợ kết dính, nhằm giữ chất dinh dưỡng trên bề mặt lá để cây hấp thụ dễ dàng. Phân bón lá dùng để bón phân qua lá, qua quả và qua thân cây.
* Tác dụng của phân bón qua lá
Phun chất dinh dưỡng qua lá sẽ tiết kiệm được phân bón, tiết kiệm thời gian mà hiệu quả mang lại cao hơn nhiều so với dinh dưỡng qua rễ. Phương pháp này càng có hiệu quả cao đối với các cây rau, hoa và cây giống các loại...
Khi sử dụng các chất có nồng độ thấp, các chất có hoạt tính sinh lý như các chất điều hòa sinh trưởng, các nguyên tố vi lượng... thì chỉ có phun qua lá mới có hiệu quả sinh lý và kinh tế nhất. Việc phun phân qua lá cũng là cách phục hồi nhanh chóng cây trồng khi có dấu hiệu thiếu dinh dưỡng hơn là bón vào đất [13].
Nhiều loại phân bón lá được đề xuất sử dụng trong nông nghiệp ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ví dụ, ở Ai Cập, trong thời gian năm năm (1990 - 1995), 554 loại phân bón mới được đăng ký, trong số đó có 285 loại là phân bón lá [42].
Nghiên cứu của Alexander và Schroeder (1987), Fageria và cs, Kannan (2010)cho thấy tiềm năng lớn của phân bón lá như là một cách để giảm ô nhiễm đất và nước ngầm [23], [44], [62].
Nghiên cứu của tác giả Pavlova và Michailova (2009) với tiêu đề “Phân bón lá - lợi ích -20 năm nghiên cứu và ứng dụng”, đã chỉ ra rằng trong 20 năm nghiên cứu và ứng dụng phân bón lá ở Bulgaria với thành phần dinh dưỡng (21%N, 5% P2O5, 10% K2O, 0,020% B, 0,014% Cu, 0,250% Fe, 0,002% Mn, 0,002% Mo và 0,018% Zn) đã chứng tỏ hiệu quả về kinh tế, giảm ô nhiễm môi trường đất và góp phần làm hạn chế việc sử dụng phân bón qua đất và tối ưu hóa việc sử dụng phân bón [93].
Việc phát hiện ra các chất kích thích sinh trưởng như auxin [124], gibberellin [65], [84], [130], cytokinin [109], [110], các chất ức chế sinh trưởng như axit abscisic [22], [73], [90], ethylen… và sử dụng các chất này làm phương tiện hóa học để điều trỉnh quá trình sinh trưởng phát triển của cây trồng được coi như bước tiến đầu tiên sử dụng chế phẩm phân bón qua lá cho cây trồng.
Phân sinh hóa cho cây trồng trên thị trường chủ yếu chứa các chất điều hòa sinh trưởng như GA3, α-NAA, IBA, Ethrel, CCC… Được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: điều khiển thời gian ra hoa của cây cũng có nghĩa là điều khiển sự cân bằng hoocmon chung trong cây. Người ta có thể làm cho cây trồng ra hoa sớm hơn (sớm đạt cân bằng giữa tác nhân kích thích và ức chế) hoặc ngược lại, làm cho cây đạt cân bằng hoocmon này muộn hơn để cây ra hoa quả muộn. Có thể sử dụng các điều kiện ngoại cảnh hoặc các biện pháp kỹ thuật để điều khiển cân bằng hoocmon chung đó của cây theo hướng có lợi cho con người.
* Cơ chế hấp thụ phân bón qua lá
Hầu hết các chất khoáng từ đất xâm nhập vào cây qua hệ thống rễ. Tuy nhiên, các bộ phận khác của cây đặc biệt là lá cũng có khả năng hấp thu chất khoáng thông qua khí khổng và tầng cutin mỏng. Đây là con đường hấp thu dinh dưỡng bị động
nên không cần năng lượng. Sự xâm nhập các chất khoáng vào cây qua bề mặt lá phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần của các chất khoáng sử dụng, nồng độ chất khoáng, pH của dung dịch chất khoáng, tuổi của lá và cây…
Cây xanh có thể hút chất dinh dưỡng ở dạng khí như CO2, O2, NH3 và NO2 từ khí quyển qua lỗ khí khổng. Đầu thế kỷ XIX, bằng phương pháp đồng vị phóng xạ các nhà khoa học đã phát hiện ra, ngoài các bộ phận lá, các bộ phận khác như thân, cành, hoa, quả, đều có khả năng hấp thu dinh dưỡng [18].
Diện tích lá của cây bằng 15 - 20 lần so với diện tích đất do tán che phủ. Lỗ khí khổng có kích thước dài 7 - 10 µm, rộng 2 - 12 µm, số lượng khá lớn, có thể chiếm tới 1% diện tích lá, phân bố ở cả mặt trên và mặt dưới lá. Số lượng lỗ khí khổng của từng loại cây khác nhau là không giống nhau. Muốn cho phân bón qua lá mang lại hiệu quả cao nhất thì phải được phun lên bề mặt lá có nhiều lỗ khí khổng