V. Phương pháp.
6.Kiểm tra các dòng vi khuẩn Azospirillum đã phân lập bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction).
PCR (Polymerase Chain Reaction).
a). Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25µl/ phản ứng).
Nước cất 2 lần 10,75
Buffer Fer 2,5
dNTPs 4
MgCl2 3
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp Trang 20 P1 (mồi ngược) 1 P2 (mồi xuôi) 1 0,1% BSA 0,25
Taq polymerase Fer 0,5
ADN 2
b). Qui trình PCR.
- Biến tính ADN ở 950C trong 5 phút.
- Tiếp theo là 30 chu kỳđược gia nhiệt như sau: + 950C trong 1 phút
+ 490C trong 1 phút + 720C trong 1 phút
- Bước cuối cùng là 720C trong 10 phút.
- Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -200C để chạy điện di.
c). Điện di
Sản phẩn ADN sau khi trích, được tiến hành khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sau đó kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% có chứa ethidium bromide. Sản phẩm gel sau khi điện di được chụp bằng máy chụp hình gel Bio - Rad UV 2000 (Hoa Kỳ).
- Chuẩn bị gel nhỏ: ( 20ml) + Agarose (1%): 0,2g +TAE buffer (1X): 20ml
- Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave). - Sau khi nấu để nguội khoảng 500 - 600C, bổ sung EtBr: 0,4µl - Rót gel vào khuôn.
- Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu. - Load mẫu: dùng Micropipet hút 10µl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10µl mẫu ADN vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
- Chạy điện di 60 phút ở 90V.
- Chụp hình gel bằng máy chụp hình gel Bio - Rad.
CBHD: PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp
Trang 21
PHẦN IV - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum I. Kết quả phân lập vi khuẩn Azospirillum