3.2.1 Chuẩn bị mẫu phân tích
Mẫu đậu nành đƣợc trữ lạnh ở nhiệt độ 5oC, một phần đƣợc xay nhuyễn tiến hành xác định độ ẩm và phân tích các thí nghiệm trên mẫu đậu nành thô, một phần chuẩn bị để nảy mầm hạt.
23
Quy trình chuẩn bị mẫu đƣợc trình bày ở Hình 3.3.
Hình 3.3 Quy trình tổng quát chuẩn bị mẫu.
Thuyết minh quy trình:
- Đậu nành đƣợc rửa sạch để loại bỏ bụi bẩn trên bề mặt, sau đó ngâm với nƣớc chảy tràn (hoặc nƣớc lọc) trong 12 giờ (mẫu 0 giờ).
- Đậu đã ngâm đƣợc vớt ra để ráo nƣớc, rửa sạch. Sau đó đậu đƣợc cho vào khay trải đều, ủ ấm, cứ 4 giờ tƣới nƣớc một lần và ủ trong điều kiện bóng tối.
Đậu nành MTĐ-760
Ngâm 12 giờ (nƣớc chảy tràn)
Gieo vào khây ở tủ nảy mầm
Lấy mẫu sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ
Bảo quản đông lạnh sau 1 ngày (đảm bảo mẫu đã đông cứng)
Đem sấy đông khô ( khoảng 72 giờ)
24
- Quá trình nảy mầm đƣợc thực hiện tại bốn nhiệt độ khác nhau 22oC, 25oC, 28oC và nhiệt độ môi trƣờng. Tiến hành lấy mẫu phân tích ở các thời điểm 0 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ và 72 giờ. Các mẫu đậu nành đƣợc lấy ra ở các thời điểm tƣơng ứng. Tiến hành loại bỏ hạt hƣ, rửa sạch, để ráo nƣớc, đông lạnh ở -20oC và sau đó đem sấy đông khô lạnh bằng máy Virtis (Mỹ). Sau khi sấy đông khô, mẫu đƣợc nghiền nhỏ và rây thành bột mịn để thực hiện các thí nghiệm phân tích.
3.2.2 Khảo sát biến đổi các thành phần hóa học chính trong đậu nành
(Glycine max) theo thời gian và nhiệt độ nảy mầm
Mục đích thí nghiệm: Tìm ra sự thay đổi hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng trong quá trình nảy mầm đậu nành và thấy đƣợc ảnh hƣởng của nhiệt độ lên sự thay đổi hàm lƣợng các chất dinh dƣỡng trong quá trình nảy mầm.
Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với hai lần lặp lại. Sử dụng mẫu nguyên liệu thô làm mẫu đối chứng.
- Nhân tố A: nhiệt độ nảy mầm + A1: 22oC
+ A2: 25oC + A3: 28oC
+ A4: nhiệt độ môi trƣờng - Nhân tố B: thời gian nảy mầm
+ B1: 0 giờ + B2: 24 giờ + B3: 36 giờ + B4: 48 giờ + B5: 60 giờ + B6: 72 giờ
- Tổng số đơn vị thí nghiệm: 6 x 4 x 2 + 1 x 2 = 50 (đơn vị). - Các chỉ tiêu phân tích bao gồm:
25
+ Hàm lƣợng lipid thô. + Hàm lƣợng đƣờng khử.
Tiến hành thí nghiệm xác định các chỉ tiêu:
3.2.2.1 Xác định độ ẩm bằng phƣơng pháp sấy khô đến khối lƣợng không đổi
Mục đích: Xác định độ ẩm bão hòa của nguyên liệu.
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hết hơi nƣớc trong sản phẩm, để sản phẩm đạt khối lƣợng không đổi, từ đó tính ra phần trăm độ ẩm của sản phẩm.
Tiến hành: Mẫu sau khi nghiền nhỏ sẽ đƣợc đặt lên đĩa nhôm của thiết bị xác định ẩm nhanh. Dùng khoảng 1g mẫu rải đều lên đĩa sau đó đợi máy phân tích cho ra phần trăm ẩm.
Tiến hành 2 lần lặp cho mỗi mẫu phân tích. Kết quả đƣợc tính trung bình của 2 lần lặp lại (giữa các lần lặp lại sai lệch không đƣợc lớn hơn 0,5%).
3.2.2.2 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng đạm tổng số (Phƣơng pháp Kjeldahl)
Mục đích: Xác định hàm lƣợng đạm tổng số của nguyên liệu.
Nguyên tắc:
Khi đun nóng mẫu có chứa nitơ trong H2SO4 đậm đặc với sự hiện diện của chất xúc tác thích hợp thì tất cả các hợp chất hữu cơ bị oxy hóa, còn NH3 đƣợc giải phóng liên kết với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4. Dùng kiềm mạnh (NaOH) trong điều kiện đun nóng đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. NH3 tạo thành đƣợc lôi cuốn bằng hơi nƣớc và đƣợc cất qua bình hứng có chứa dung dịch acid boric và hỗn hợp thuốc thử.
Các phản ứng xảy ra trong quá trình thực hiện: Chất hữu cơ + H2SO4 → (NH4)2SO4
(NH4)2SO4 + 2NaOH → 2NH4OH + Na2SO4 NH4OH → NH3 + H2O
NH3 + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7
Sau đó định lƣợng amoni tetraborat tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N theo phản ứng sau:
26
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
Tiến hành
- Đốt đạm (vô cơ hóa mẫu)
Cân 0,1g mẫu đã đƣợc làm nhỏ cho vào bình Kjeldahl, sau đó thêm 8ml H2SO4 đậm đặc. Để rút ngắn thời gian vô cơ hóa, thêm vào 0,7g chất xúc tác (K2SO4:CuSO4:Se) (100:10:1). Đặt bình vào hệ thống vô cơ hóa mẫu, trong tủ hút hơi đun sôi và luôn giữ cho bình sôi nhẹ khoảng 2 – 3 giờ cho đến khi dung dịch trong bình Kjeldahl trong suốt. Để nguội, cho một ít nƣớc cất vào tráng nhẹ thành bình thấy không còn những hạt muội đen li ti là quá trình vô cơ hóa đã kết thúc.
- Lôi cuốn đạm
Đặt bình Kjeldahl có chứa mẫu đã vô cơ hóa vào hệ thống chƣng cất mẫu. Cho 10ml nƣớc cất vào bình, thêm vào 30ml dung dịch NaOH 30%. Hút chính xác 20ml dung dịch acid boric 2% có chứa hỗn hợp thuốc thử vào bình tam giác 250ml. Đặt bình hứng vào hệ thống chƣng cất mẫu sao cho đầu ống sinh hàn ngập trong dung dịch acid boric.
Tiến hành chƣng cất khoảng 30 phút, sau đó dùng giấy quì tím để kiểm tra sự kết thúc quá trình lôi cuốn đạm. Nếu giấy quỳ không chuyển sang màu xanh là quá trình lôi cuốn kết thúc. Dùng nƣớc cất để rửa đầu ống sinh hàn, sau đó lấy bình ra tiến hành chuẩn độ.
- Chuẩn độ
Dùng dung dịch H2SO4 0,1N để chuẩn độ dung dịch trong bình hứng cho đến khi dung dịch chuyển từ xanh sang hồng nhạt. Ghi nhận thể tích dung dịch H2SO4 0,1N đã dùng.
Tính toán kết quả
Hàm lƣợng nitơ tổng số (N) có trong mẫu đựơc tính theo công thức: Trong đó:
m: Khối lƣợng nguyên liệu đem phân tích (g)
27
a: Thể tích H2SO4 0,1N đã dùng cho mẫu phân tích (ml) 0,0014: Số gam nitơ tƣơng đƣơng với 1ml H2SO4 0,1N Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo công thức:
Hàm lƣợng protein (%) = N * H (với H = 5,71)
Kết quả thí nghiệm là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại.
3.2.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng chất béo bằng máy Soxhlet
Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hòa tan của lipid trong dung môi hữu cơ không phân cực, dùng dung môi hữu cơ để trích lipid ra khỏi nguyên liệu đã đƣợc nghiền nhỏ. Trong quá trình trích, các hợp chất tan đƣợc trong chất béo nhƣ các sắc tố, các vitamin tan trong chất béo…, cũng bị tách ra khỏi nguyên liệu. Do có lẫn các tạp chất khác, nên thành phần trích ly đƣợc gọi là lipid tổng số hay lipid thô.
Có 2 phƣơng pháp xác định:
+ Phƣơng pháp trực tiếp: Trích lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lƣợng lipid đƣợc trích ly.
+ Phƣơng pháp gián tiếp: Xác định độ chênh lệch khối lƣợng nguyên liệu khô trƣớc và sau khi chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu, từ đó suy ra khối lƣợng lipid trong mẫu phân tích.
Tiến hành: Sấy khô nguyên liệu đã đƣợc nghiền nhuyễn đến khối lƣợng không đổi. Cân chính xác khoảng 1g nguyên liệu (sử dụng cân phân tích), cho vào túi giấy lọc đã đƣợc sấy khô và biết khối lƣợng (túi giấy phải có đƣờng kính nhỏ hơn đƣờng kính trụ chiết và chiều dài phải ngắn hơn chiều cao của ống chảy tràn).
Đặt túi giấy có chứa mẫu vào trụ chiết.
Lắp trụ chiết vào bình cầu (đã đƣợc sấy khô và xác định khối lƣợng) và lắp ống sinh hàn.
Mở nƣớc vào ống sinh hàn.
Đặt hệ thống Soxhlet lên bếp cách thủy và điều chỉnh nhiệt độ sao cho chu kì hoàn lƣu của dung môi đạt 5 – 8 lần trong một giờ. Chiết trong 8 – 12 giờ cho đến khi trích ly hoàn toàn chất béo. Thử thời điểm kết thúc quá trình trích bằng cách lấy vài giọt ether từ đầu cuối trụ chiết cho lên đĩa kính đồng hồ sạch. Sauk hi
28
dung môi bay hơi hết, trên mặt kính đồng hồ không để lại vết dầu loang thì xem nhƣ lipid đã đƣợc chiết hết hoàn toàn.
Sau khi chiết xong, lấy bình cầu và túi đựng mẫu ra, lấy ống sinh hàn lắp vào bình cầu mới và cất thu hồi ether.
Tính toán kết quả: Sấy bình cầu có chứa lipid đến khối lƣợng không đổi, cân xác định khối lƣợng. Nếu chiết bằng ether ethylic thì sấy khô ở 60 – 70oC trong vào 30 phút, còn chiết bằng ether dầu hỏa thì sấy ở 80 – 90oC trong 45 – 50 phút.
Hàm lƣợng lipid (X) có trong 100 gram nguyên liệu đƣợc tính theo công thức sau:
Trong đó:
X: Hàm lƣợng lipid tính theo phần trăm. a: Khối lƣợng mẫu ban đầu trƣớc khi chiết (g). b: Khối lƣợng mẫu sau khi chiết (g).
3.2.2.4 Phƣơng pháp định lƣợng đƣờng khử bằng 3,5 – acid dinitrosalycylic
Xác định lƣợng đƣờng khử có trong mẫu đậu nành bằng phƣơng pháp acid dinitrosalycylic (DNS) theo Miller (1959).
Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử với thuốc thử acid dinitrosalycylic (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. Đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm. Dựa theo đồ thị đƣờng chuẩn của glucose tinh khiết với acid dinitrosalycylic (DNS) sẽ tính đƣợc hàm lƣợng đƣờng khử của mẫu phân tích.
29
Phƣơng trình phản ửng
Tiến hành thí nghiệm
Thuốc thử DNS được pha như sau:
- Sodium possium tartrate (hòa tan 30g muối này vào 30ml nƣớc). - NaOH (hòa tan 1,5g NaOH vào 10ml nƣớc).
- 3,5 –Dinitrosalicylic acid: hòa tan 1g DNS vào 40ml nƣớc.
- Pha hỗn hợp 3 dung dịch này vào bình định mức 100ml, thêm nƣớc cất cho tới vạch.
Dung dịch đường chuẩn glucose thí nghiệm: pha loãng 1 thể tích dung dịch glucose dự trữ thành 4 lần trƣớc khi sử dụng. Dung dịch đƣờng cuối cùng có nồng độ 250µg/ml.
Tiến hành phản ứng
Cân 3g bột đậu nành vào bình tam giác 100ml, thêm 30ml nƣớc cất. Tiến hành thủy phân trong 30 phút (thỉnh thoảng lắc bình). Kết thúc thủy phân, định mức dung dịch đến 100ml, lọc lấy dịch.
Hút 3ml dung dịch mẫu có chứa đƣờng vào một ống nghiệm. Thêm vào 1ml thuốc thử DNS.
Chuẩn bị ống thử không bằng cách thêm 1ml thuốc thử DNS vào 3ml nƣớc cất.
Dùng nắp bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nồi nƣớc đang sôi trong 5 phút. Làm lạnh về nhiệt độ phòng và đo độ hấp thu quang (OD) ở bƣớc sóng 540nm. Dùng ống thử không để chuẩn độ truyền suốt về 100%. Chú ý là tất cả các ống nghiệm cần phải đƣợc làm lạnh về nhiệt độ phòng trƣớc khi đo bởi vì độ hấp thu rất nhạy với nhiệt độ.
30
Dựng đồ thị chuẩn
Cân chính xác 1g glucose (dạng khô không ngậm nƣớc) hòa tan thành 200ml với nƣớc cất. sử dụng bình định mức.
Hút lần lƣợt 1, 2, 3, 4 và 5ml dung dịch đƣờng này vào 5 bình định mức 50ml. Thêm nƣớc cho đến vạch định mức.
Các dung dịch đƣờng mới pha này có nồng độ đƣờng glucose lần lƣợt là 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 và 0,5µg/ml.
Thực hiện phản ứng nhƣ trên.
Vẽ đồ thị thể hiện sự biến thiên giữa nồng độ đƣờng và độ hấp thu quang (OD) ở bƣớc sóng 540nm.
Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc xác định dựa trên đƣờng chuẩn. Với khối lƣợng mẫu đem phân tích là m gam và pha loãng n lần Hàm lƣợng đƣờng khử đƣợc tính theo công thức: ( ) Trong đó: a, b: hệ số góc của đƣờng chuẩn. n: hệ số pha loãng. 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Thí nghiệm đƣợc tiến hành ngẫu nhiên với 2 lần lặp lại, kết quả đƣợc tính toán bằng phần mềm Excel, phần mềm thống kê Minitab 16. Kết quả phân tích ANOVA với độ tin cậy 95%.
31
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Sự thay đổi độ ẩm của đậu nành theo thời gian và nhiệt độ nảy mầm mầm
Việc xác định độ ẩm hạt đậu nành đƣợc xác định cho việc quy đổi hàm lƣợng các chất phân tích theo thời gian nảy mầm khác nhau và so sánh với nguyên liệu thô ban đầu. Ngoài ra, việc xác định độ ẩm đậu nành còn cho biết khả năng hấp thu nƣớc của hạt trong thời gian nảy mầm. Vì vậy, cần phải xác định chính xác yếu tố này, kết quả đƣợc ghi nhận ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1 Độ ẩm (%) của đậu nành nảy mầm theo thời gian và nhiệt độ
Thời gian nảy mầm (giờ)
Độ ẩm của đậu nảy mầm (%)
22 25 28 Nhiệt độ môi trƣờng 0 37,36 37,70 37,57 37,82 24 53,43 44,78 57,3 52,31 36 54,18 58,85 66,67 53,11 48 57,69 61,01 69,55 57,90 60 60,12 63,64 70,26 60,90 72 65,05 64,22 72,09 71,03
Độ ẩm của hạt mẫu thô là 10,13%.
Theo kết quả trên, cho thấy độ ẩm hạt bị ảnh hƣởng bởi thời gian nảy mầm và nhiệt độ nảy mầm. Độ ẩm hạt tăng đều theo thời điểm nảy mầm thể hiện đặc tính quan trọng trong quá trình nảy mầm, đó chính là sự hấp thu nƣớc. Nƣớc là yếu tố cơ bản của sự nảy mầm bởi nó cần thiết cho các enzyme hoạt động, phá vỡ vỏ hạt và vận chuyển vật chất. Trong quá trình phát triển, hạt hút nƣớc từ bên ngoài để thực hiện tiến trình nảy mầm[42]. Do đó, so với độ ẩm của mẫu thô ban đầu thì độ ẩm của mẫu ngâm 12 giờ (0 ngày nảy mầm) tăng nhanh từ 10,13% lên 37,82% (gấp 3,7 lần). Tăng nhẹ ở các ngày nảy mầm tiếp theo và đạt đỉnh cao nhất hơn 70% ở mẫu 72 giờ (tăng gấp 7 lần). Độ ẩm tăng theo thời gian nảy mầm. Và khi điều kiện nhiệt độ nảy mầm tăng thì độ ẩm cũng tăng theo và độ ẩm của đậu nành nảy mầm đạt cực đạt 280C. Do trong quá trình nảy mầm, các hoạt động của enzyme và vận chuyển vật chất đƣợc thúc đẩy nhanh chóng dẫn đến sự hút nƣớc mạnh từ ngoài vào trong hạt. Đồng thời, sự có mặt của lipid, tanin và pectin trong vỏ hạt cũng có đóng góp vào sự thấm nƣớc của vỏ hạt.
32
Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của Silva H. C. và cộng sự[43] (1990) khi phân tích trên ba giống đậu nành Brazil và nghiên cứu của Ramadan E. A.[44] (2012) trên hai giống đậu nành Giza 21 và Giaza 35. Độ ẩm của hạt nảy mầm tăng đều theo thời gian nảy mầm, tăng nhanh ở ngày đầu và tăng nhẹ ở các ngày sau. Ngoài ra, mức độ tăng độ ẩm hạt khác nhau ở các giống và điều kiện nảy mầm khác nhau.
4.2 Hàm lƣợng protein tổng số của đậu nành theo thời gian và nhiệt độ nảy mầm nảy mầm
Hàm lƣợng protein tổng số của các mẫu đậu nành nảy mầm (%, tính trên căn bản khô) đƣợc kết quả ghi nhận thể hiện ở Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Hàm lƣợng protein tổng số của đậu nành nảy mầm theo thời gian và nhiệt độ (%)
Thời gian nảy mầm (giờ) Nhiệt độ nảy mầm (oC) Trung bình nghiệm thức 22 25 28 Nhiệt độ môi trƣờng 0 37,21 39,18 38,54 39,08 38,50a 24 39,58 39,98 41,81 40,62 40,49b 36 39,94 43,76 43,92 42,53 42,53c 48 40,83 44,26 45,21 43,58 43,47d 60 41,39 45,76 47,78 44,21 44,78e 72 42,02 47,93 49,72 45,21 46,22f Trung bình nghiệm thức 40,16 a 43,48c 44,49d 42,53b
Chú ý: Các trung bình nghiệm thức đi kèm với các chữ cái giống nhau trong cũng một cột hoặc hàng không có sự khác biệt ý nghĩa với mức ý nghĩa 5%.
Hàm lƣợng protein (%) ở mẫu thô là 38,27.
Dựa vào Bảng 4.2 cho thấy, hàm lƣợng protein có khuynh hƣớng tăng nhẹ dần theo thời gian nảy mầm và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Hàm lƣợng protein đạt cao nhất 46,22% ở 72 giờ nảy mầm và tăng 8,05% so với mẫu thô 38,27%. Hàm lƣợng protein tăng cao nhất ở điều kiện nhiệt độ nảy mầm 28oC.
Do có một số thay đổi về số lƣợng và chất lƣợng xảy ra trong quá trình nảy mầm hạt giống, đặc trƣng nhất cho sự biến đổi sinh hóa đó là sự tăng đột ngột các
33
hoạt động thủy phân xảy ra trong hạt. Đồng thời, trong quá trình nảy mầm, ở nhân xảy ra quá trình phiên mã mRNA để tổng hợp protein. Vì vậy, hàm lƣợng protein tổng số tăng dần theo thời gian và nhiệt độ nảy mầm.
Kết quả này tƣơng tự với nghiên cứu của Ndonda Charles Kayembe[36] (2011) trên giống đậu nành châu Phi, hàm lƣợng protein tăng dần theo ngày nảy mầm, ngày nảy mầm thứ 3 tăng 11% và ngày thứ 6 tăng 15% so với mẫu thô ban đầu. Và khi đối chiếu với kết quả của Ramadan E. A.[44] (2012) trên hai giống đậu