IX. ĐỊNH LƯỢNG A-XIT LĂC-TIC (CH3-CHOH-COOH)
X.3. Tiến hành phân tích
X.3.1. Chuẩn bị cột hấp thụ:
- Nếu không tìm được cột hấp phụ chuyên dùng cho sắc ký thì nên dùng buret 50 ml có đường kính 1cm, cắt 1 đọan dài 12 cm.
- Kỹ thuật nhồi bông: lót lớp dưới đáy cột lớp bông thủy tinh dày 1cm. Trong một cốc 50ml, cho oxit nhôm họat tính hòa với n-hexan hoặc ether dầu hỏa, rót oxit nhôm và n-hexan qua phểu vào cột. Cẩn thận để cột không bị khô bằng cách thêm một ít n-hexan vào.
X.3.2. Chiết mẫu:
Cân khỏang 0.5 g mẫu ở trạng thái gần khô cho vào bình tam giác 50ml, thêm vào 10ml axeton, đậy nút kín. Cho vào tủ lắc, lắc liên tục trong 2 giờ hoặc để qua đêm. Cho dịch lọc qua phểu có lót lớp bông thủy tinh và Na2SO4 khan vào bình định mức 50ml. Đảm bảo mẫu luôn luôn giữ một lớp dung môi dày 1-2 cm để tránh caroten bị oxi hóa. Tiến hành rửa bằng axeton cho đến khi dịch chiết không màu thì ngưng. Điều chỉnh dịch lọc vừa đủ 50ml (gọi là V1).
Lấy 10ml từ dung dịch V1, gọi là V2, làm khô dịch chiết trong nồi chưng cach thủy ở nhiệt độ khỏang 45oC, ở áp suất thấp. Nên sử dụng khí nitrogen để tránh caroten bị oxy của không khí oxi hóa. Sau khi axeton đã bốc hơi hết, nhanh chóng cho vào 5ml n-hexan lắc đều cho hỗn hợp sắc tố - caroten tan đều trong dung môi.
Lấy dung dịch V2 đã xử lý cho vào cột hấp thụ, tráng rửa vật chứa và phểu hứng bằng một lượng tối thiểu n-hexan, khỏang 5ml và cho tất cả vào cột sắc ký. Mở khóa buret ở mức tối đa cho dung dịch đi qua cột sắc ký, một lúc sau ta thấy một vệt vàng cam xuất hiện đi dần xuống bên dưới. Dùng ống nghiệm khô sạch 20ml để hứng dung dịch caroten thu được bên dưới, kiểm tra bằng cách thử phản ứng định tính caroten bằng antimon triclorua bảo hòa trong chloroform cho đến khi phản ứng âm tính, ngừng rửa cột.
Điều chỉnh dung dịch đồng phân caroten qua cột sắc ký về thể tích 20 ml, gọi là V3 , đem so màu dung dịch V3 ở bước sóng 440nm. Đọc kết quả trên đường cong chuẩn ta có nồng độ caroten/ml dung dịch.
Hàm lương caroten trong 1 kg thức ăn được tính theo công thức sau: V1 x V3 x C
Caroten = --- x 1000 V2 x W
Với X : mg caroten /kg thức ăn
V1: thể tích dịch chiết hổn hợp sắc tố aceton (V1 = 50ml) V2: thể tích dịch chiết đem xử lý (10ml)
V3: thể tích dung dịch đồng phân caroten thu được qua cột sắc ký ( 20ml) C: mg caroten tương ướng với 1 ml dung dịch đem so
W: khối lượng mẫu (g)