M U
2.3.4. Ph ng pháp quan sát các đc đ im phân l oi
2.3.4.1. Quan sát các đ c đi m v mô sau đơy b ng m t th ng ho c d i kính hi n vi soi n i
- Màu s c bào t (conidial color): chính là màu s c c a bông n m, đây là đ c đi m quan tr ng đ phân lo i đ n m c chi ph .
- ng kính khu n l c (colony diameter): kích th c l n nh t c a m t trong 3 khu n l c nuôi trên cùng m t h p l ng.
- Màu s c h s i (mycelial color): th ng có màu tr ng nh ng m t s loài có màu khác.
- D ch ti t trên b m t h s i (exudate): là các gi t l ng nh , đ c hình thành trên b m t h s i.
23
- Màu c a m t sau khu n l c (reverse color): là màu s c quan sát đ c phía d i khu n l c b ng cách nhìn t phía d i đ a th ch. Màu s c này th ng ph thu c vào môi tr ng.
- S c t hòa tan (Soluble pigment): là s c t khu ch tán vào agar theo vi n c a khu n l c.
- H ch n m (Sclerotia): là các kh i c ng g m các s i n m, th ng hình c u, g n c u ho c elip, không ch a bào t .
- Th qu (cleistothecia): đây là các th qu không t m , nó ch a các túi bào t mà bên trong là các bào t túi.
2.3.4.2. Quan sát vƠ xác đ nh các đ c đi m vi mô d i kính hi n vi quang h c và ch p nh qua kính hi n vi (Axioskop)
- Giá bào t tr n (conidiophore, tipe): xác đnh chi u dài, màu s c và c u trúc b m t c a giá bào t tr n, đây là đ c đi m quan tr ng đ phân lo i. - B ng đ nh giá (versicle): là đ nh ph ng lên c a cu ng bào t n m. Quan
sát hình d ng và đo kích th c.
- Các l p th bình (Seriation): quan sát s t ng th bình.
- Bào t tr n (conidia): hình thái, kích th c và c u trúc b m t là đ c đi m quan tr ng.
- Bông n m (conidial head): quan sát hình d ng bông n m. - T bào Hulle: thành dày, có tính khúc x cao.
- Bào t túi: màu s c, kích th c, cách trang trí c a bào t túi, bao g m các g n i, ho c các đ ng rãnh bao xung quanh bào t túi và c u trúc b m t c a thành l i.
24
CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N
3.1. K t qu phân l p
T 9 m u thu th p đ c tôi ti n hành phân l p trên môi tr ng Crapek- Dox c s trong 2 đ n 4 ngày đã thu đ c 30 ch ng n m m c. K t qu phân l p đ c trình bày c th b ng b ng 3.1. B ng 3.1. Các ch ng n m m c phân l p đ c STT M u Ch ng m c c đi m c a ch ng M u c a khu n l c Th i gian xu t hi n 1 1 M1-1 en 2 ngày 2 1 M1-2 Nâu nh t 3 ngày 3 1 M1-3 Nâu đ m 2 ngày
4 1 M1-4 Xanh rêu 2 ngày
5 2 M2-1 en 4 ngày
6 2 M2-2 en 2 ngày
7 2 M2-3 Xám 2 ngày
8 3 M3 Xanh l c 3 ngày
9 3 M3-2 Nâu đ m 3 ngày
10 3 M3-3 Xanh đen 4 ngày
11 3 M3-6 en 2 ngày
12 4 M4-1 Xanh rêu 4 ngày
13 4 M4-2 Tr ng 3 ngày
14 4 M4-3 Vàng nh t 3 ngày 15 5 M5-1 Xanh rêu 4 ngày 16 5 M5-3 Vàng hoa cau 3 ngày 17 5 M5-6 Vàng hoa cau 3 ngày
18 6 M6-1 en nâu 2 ngày
19 6 M6-2 Nâu 4 ngày
20 6 M6-3 Xám 3 ngày
21 6 M6-4 Xám xanh 2 ngày
22 7 M7-1 Tr ng 2 ngày
23 7 M7-2 Xanh rêu 4 ngày
24 7 M7-3 Nâu đ m 3 ngày 25 8 M8-1 Nâu 2 ngày 26 8 M8-2 Nâu nh t 3 ngày 27 8 M8-3 Vàng nh t 3 ngày 28 9 M9-1 Nâu 4 ngày 29 9 M9-2 Tr ng m n 3 ngày
25
M i m u phân l p đ u thu đ c t 3 đ n 4 ch ng n m m c có hình thái khu n l c khác nhau. Các khu n l c c a các ch ng này ch y u xu t hi n sau 2 đ n 3 ngày, m t s ít xu t hi n sau 4 ngày nuôi c y.
Trên môi tr ng Crapek-Dox, c n m m c, x khu n và m t s vi khu n đ u có th m c đ c. Nh ng ta có th phân bi t rõ ràng các khu n l c c a n m m c v i các khu n l c c a vi khu n và x khu n: khu n l c c a n m m c th ng d ng x p h n do kích th c s i n m to h n, phát tri n nhanh h n và to h n nhi u l n so v i các khu n l c c a x khu n và vi khu n; khu n l c vi khu n th ng nhày, t và nh n; khu n l c c a x khu n thì bông, x p, khô, r n ch c, xù xì, nh ng tr ng h p không có h s i khí sinh thì khu n l c có d ng màng d o.
K t qu th hi n b ng 3.1 cho th y các ch ng n m m c V nh Phúc khá là đa d ng, có ti m n ng cho nhi u ng d ng th c t nh s n xu t enzyme, s n xu t kháng sinh, x lý rác th i,…
3.2. K t qu th ho t tính
M c tiêu c a đ tài là tuy n ch n các ch ng n m có kh n ng sinh cellulase phân h y cellulose nên tôi ti n hành th ho t tính trên môi tr ng Crapek-Dox thay ngu n c ch t b ng CMC theo ph ng pháp khu ch tán trên đ a th ch: dùng khoan nút chai, khoan các l trên môi tr ng th ho t tính (môi tr ng th ch ch a 1% CMC). Nh vào m i l khoan dung d ch enzyme thu đ c sau khi nuôi c y chìm. t l nh 6-8 gi cho enzyme khu ch tán vào môi tr ng th ch sau đó cho vào t m 320C trong 24gi . Hi n hình vòng phân gi i b ng dung d ch thu c th liugon đ 1%.
Ho t tính c a enzyme đ c xác đnh b ng hi u s D - d (mm). Trong đó D: là đ ng kính vòng phân gi i; d: là đ ng kính l đ c. K t qu chi ti t đ c trình bày c th b ng 3.2.
26 B ng 3.2. Ho t tính cellulase c a các ch ng n m m c STT Ch ng m c Ho t tính cellulase (D-d, mm) STT Ch ng m c Ho t tính cellulase (D-d, mm) 1 M1-1 6 16 M5-3 20 2 M1-2 13 17 M5-6 13 3 M1-3 5 18 M6-1 18 4 M1-4 11 19 M6-2 11 5 M2-1 7 20 M6-3 10 6 M2-2 12 21 M6-4 6 7 M2-3 5 22 M7-1 7 8 M3 22 23 M7-2 13 9 M3-2 10 24 M7-3 15 10 M3-3 12 25 M8-1 5 11 M3-6 11 26 M8-2 6 12 M4-1 10 27 M8-3 7 13 M4-2 8 28 M9-1 12 14 M4-3 7 29 M9-2 13 15 M5-1 8 30 M9-3 14 K t qu b ng 3.2 cho th y t t c 30 ch ng n m m c phân l p đ u có ho t tính cellulase. Trong đó, có 12 ch ng có ho t tính nh h n 10 mm, 15 ch ng có ho t tính t 10 – 15 mm và 3 ch ng có ho t tính l n h n 15 mm là ch ng M3 (22 mm), M5-3 (20 mm), M6-1 (18 mm). M3 M5-3 M6-1 Hình 3.1. Ho t tính cellulase c a 3 ch ng m nh nh t
27
Sau khi xác đ nh đ c 3 ch ng M3, M5-3 và M6-1 là có ho t tính cellulase cao nh t v i ho t tính l n l t là 22 mm, 20 mm và 18mm, tôi so sánh ho t tính c a 3 ch ng này v i các k t qu c a các nghiên c u khác đã đ c công b và th y r ng 3 ch ng này có ho t tính cellulase t ng đ i m nh nên tôi quy t đnh ch n 3 ch ng M3, M5-3 và M6-1 đ nghiên c u đnh lo i.
3.3. K t qu đnh lo i s b 3.3.1. B n mô t ch ng M3
B ng ph ng pháp nh n di n n m m c truy n th ng (Maren A. Klich, 2002), tôi đã b c đ u xác đ nh đ c ch ng M3 thu c chi Penicillium do nó có các đ c đi m hình thái r t gi ng v i các đ c đi m hình thái c a chi Penicillium trong khóa phân lo i c a Samson và CS (1995). Nh ng đ c đi m hình thái c a ch ng M3 đ c miêu t c th nh sau:
c đi m hình thái khu n l c:
- ng kính khu n l c (mm) trên môi tr ng Crapek-Dox c s : 30 mm sau 7 ngày nuôi c y.
- c đi m m t tr c khu n l c: khu n l c có màu xanh l c gi a, rìa màu xám xanh.
- c đi m m t sau khu n l c: có màu nâu t i, không nh n.
C u t o c quan sinh s n vô tính:
- Giá bào t tr n (conidiophore, tipe): chia nhánh, d ng m nh, h i nh n. - Bông n m (conidial head): hình cái ch i.
- B ng đ nh giá (vesicle): hình đ , bàn chang. - Các l p th bình (seriation): l ng t ng.
28
- Bào t tr n (conidia): có hình ovan, c u, b m t h i ráp.
M t tr c khu n l c M t sau khu n l c
Bông n m (X10) Bông n m (X40)
29
Bào t (X40) Bào t (X100)
Hình 3.2. M t s đ c đi m hình thái c a ch ng M3 3.3.2. B n mô t ch ng M5-3
B ng ph ng pháp nh n di n n m m c truy n th ng (Maren A. Klich, 2002), tôi đã b c đ u xác đ nh đ c ch ng M5-3 thu c chi Aspergillus do ch ng này có nh ng đ c đi m hình thái r t gi ng v i các đ c đi m hình thái c a chi Aspergillus trong khóa phân lo i c a Raper & Fennell (1965). Nh ng đ c đi m hình thái c a ch ng M5-3 đ c miêu t c th nh sau:
c đi m hình thái khu n l c:
- ng kính khu n l c (mm) trên môi tr ng Crapek-Dox c s : 40 mm sau 7 ngày nuôi c y.
- c đi m m t tr c khu n l c: bào t màu vàng hoa cau, vàng t i, rìa khu n l c có màu vàng h i xanh, h s i khí sinh t tr ng đ n vàng nh t. - c đi m m t sau khu n l c: màu vàng t i, không nh n.
30
- Giá bào t tr n (conidiophore, tipe): không phân nhánh, h i ráp, thành dày.
- Bông n m (conidial head): hình bán c u, g n c u. - B ng đ nh giá (versicle): hình bán c u, hình c u.
- Các l p th bình (seriation): đ n t ng bao ph 70-90%. - Bào t tr n (conidia): hình c u.
M t tr c khu n l c M t sau khu n l c
31
B ng đ nh giá (X100) B ng đ nh giá (X100)
Bào t (X40) Bào t (X100)
Hình 3.3. M t s đ c đi m hình thái c a ch ng M5-3 3.3.3. B n mô t ch ng M6-1
B ng ph ng pháp nh n di n n m m c truy n th ng (Maren A. Klich, 2002), tôi đã b c đ u xác đ nh đ c các đ c đi m v hình thái c a ch ng M6-1, ch ng này có r t nhi u đ c đi m gi ng v i nhóm loài Apergillus niger (theo khóa phân lo i c a Raper & Fennell, 1965). Do đó tôi xác đnh ch ng M6-1 thu c nhóm loài Apergillus niger, đây là m t trong nh ng nhóm loài đ c x p vào danh m c các sinh v t an toàn. c đi m c a ch ng M6-1 đ c miêu t c th nh sau:
32
c đi m hình thái khu n l c:
- ng kính khu n l c (mm) trên môi tr ng Crapek-Dox c s : 55 mm sau 7 ngày nuôi c y.
- c đi m m t tr c khu n l c: bào t màu đen h i nâu, có vòng tr ng ng n cách ph n gi a khu n l c v i ph n rìa khu n l c.
- c đi m m t sau khu n l c: màu cam, nâu, nh n.
C u t o c quan sinh s n vô tính:
- Giá bào t tr n (conidiophore, tipe): không phân nhánh, nh n, th ng và r t dày.
- Bông n m (conidial head): hình c u.
- B ng đ nh giá (versicle): d ng c u, bán c u.
- Các l p th bình (seriation): đ n t ng, bao ph 50-80%.
- Bào t tr n (conidia): đa s hình ovan và elip, m t s hình c u.
33
Bông n m (X10) Bông n m (X40)
B ng đ nh giá (X100) B ng đ nh giá (X100)
Bào t (X40) Bào t (X100)
34
K T LU N
Các k t qu thu đ c đã đáp ng đ c m c tiêu nghiên c u ban đ u c a đ tài:
1. T các m u rác th i, cành g , lá cây, r m d m c, đ t mùn đ c l y các vùng Yên L c, Xuân Hòa (Phúc Yên) và thành ph V nh Yên c a t nh V nh Phúc, đã phân l p đ c 30 ch ng n m m c, t t c 30 ch ng n m m c này đ u có kh n ng t ng h p cellulase phân gi i cellulose. K t qu này cho th y các ch ng n m m c có kh n ng sinh cellulase V nh Phúc khá là đa d ng, có ti m n ng cho nhi u ng d ng th c ti n.
2. Trong 30 ch ng có ho t tính cellulase thì có 3 ch ng M3, M5-3 và M6-1 là có ho t tính cellulase cao nh t, ho t tính c a 3 ch ng này l n l t là 22 mm, 20 mm và 18 mm.
3. ã b c đ u đ nh lo i s b đ c 3 ch ng M3, M5-3 và M6-1. Trong đó ch ng M3 thu c chi Penicillium, ch ng M5-3 và M6-1 thu c chi Aspergillus. Riêng ch ng M6-1 đ c tôi nghiên c u sâu h n và đã đnh lo i đ n loài, theo đó ch ng M6-1 thu c nhóm loài Aspergillus niger là m t trong nh ng loài thu c danh m c sinh v t an toàn, vì v y h a h n cho r t nhi u ng d ng th c t ph c v cho đ i s ng.
KI N NGH
1. Các ch ng trên m i ch đ c phân lo i s b d a vào hình thái là ch y u. phân lo i m t cách chính xác các ch ng n m trên c n ph i k t h p thêm ph ng pháp phân lo i b ng k thu t sinh h c phân t .
2. Ba ch ng M3, M5-3 và M6-1 có ho t tính cellulase t ng đ i m nh nên c n có các nghiên c u ti p theo đ đánh giá h t ti m n ng và ng d ng c a 3 ch ng này, đ c bi t là ch ng M6-1 thu c loài Apergillus niger là m t trong nh ng loài thu c danh m c sinh v t an toàn.
35
TÀI LI U THAM KH O
T NG VI T
[1] Bùi Xuân ng, Nguy n Huy V n, (2001). Vi n m dùng trong công ngh sinh h c, NXB KH & KT Hà N i, trang: 13-16, 154-168.
[2] Chu Th Thanh Bình, Nguy n Lân D ng, L ng Thùy D ng. “Phân l p, tuy n ch n và nghiên c u các ch ng n m men có kh n ng phân gi i cellulose nh m ng d ng trong x lý bã th i hoa qu làm th c n ch n nuôi”.
[3] Nguy n Lân D ng, oàn V n M u, Nguy n Phùng Ti n, ng c Tr ch, Ph m V n Ty (1972). M t s ph ng pháp nghiên c u vi sinh v t h c. Nxb Khoa h c K thu t. 325 – 378.
[4] Nguy n Th Mai Hoa (2004). “Nghiên c u phân lo i các ch ng thu c chi Aspergillus phân l p t r ng ng p m n Nam nh và Thái Bình”. Lu n v n th c s sinh h c.
[5] Trnh ình Khá, Quy n ình Thi, Nguy n S Lê Thanh (2007). “Tuy n ch n và nghiên c u nh h ng c a các y u t môi tr ng lên kh n ng sinh t ng h p cellulase c a ch ng penicillium SP. DTQ-HK1”. T p chí Công ngh Sinh h c 5 (3): 355 – 362.
TI NG ANH
[6] B. Botton A. Breton M. Fevres. Gauthier Ph. Guy, (1990), Moisissures Utiles et Nuisibles Importance Industrielle, 2nd edition, Masson, Paris Milan