3. Nội dung nghiên cứu
3.1.1.Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào cây dừa cạn nhờ A.
tumefaciens
Hạt dừa cạn được khử trùng bằng cồn 70% lắc trong 1 phút và javen 60% lắc trong 15 phút, sau đó cho nảy mầm trên môi trường MS đến khi cây con phát triển (hình 3.1 A-B), lá mầm được tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu nhận gen.
A B
C Hình 3.1. Gieo hạt tạo cây con in vitro
A: Gieo hạt dừa cạn trên môi trường MS;
Lá mầm được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100 M trong 30 phút (hình 3.2).
Hình 3.2. Ngâm mảnh lá mầm trong dịch huyền phù vi khuẩn
Sau đó thấm khô, cấy trên môi trường môi trường CCM. Nuôi trong tối 3 ngày (hình 3.3).
Hình 3.4. Mẫu được thấm khô và đặt lên môi trường SIM
Hình 3.6. Chọn lọc kéo dài chồi trên SEM
Các chồi nhỏ sống sót kéo dài trên môi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin được chuyển sang môi trường ra rễ RM và sau đó đem trồng lên giá thể (hình 3.7), cây tái sinh được đưa ra môi trường tự nhiên.
Chúng tôi tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A. tumefaciens qua nách lá mầm hạt chín của cây dừa cạn, các giai đoạn nuôi
cấy và chọn lọc, kết quả như sau: Lá mầm được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M trong 30 phút. Sau khi đồng nuôi cấy 3 ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc và tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. Các mẫu tạo chồi được đưa sang môi trường chọn lọc như trên để tránh các mẫu chết sản sinh ra các chất làm ức chế tái sinh ở các mẫu tạo chồi. Chồi đạt chiều cao 2 – 3 cm được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l. Cây con có chiều cao 8 – 10 cm và rễ đạt từ 5 – 7 cm được đưa ra giá thể. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thống kê số lượng các mẫu chuyển gen vào cây dừa cạn Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Số cây chồi kéo dài Số chồi ra rễ Số cây sống trên giá thể Lần 1 300 100 32 18 7 Lần 2 366 97 33 22 8 ĐC 0* 50 0 0 0 0 ĐC*1 50 18 13 10 5
Ghi chú: * ĐC0 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh. *ĐC1 lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh
Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh lá mầm (Bảng 3.1) thu được 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài trên môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 40 chồi ra rễ khỏe mạnh và thu được 15 cây T0 phát triển trên giá thể.
Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx,
chúng tôi có bố trí hai lô đối chứng là ĐC0 và ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu). Kết quả là lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen được cấy trên môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), các lá mầm đều bị đào thải bởi kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy trên tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu được 5 cây tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng.
Các cây dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm được trồng, chăm sóc ngoài môi trường tự nhiên khoảng 4 tuần thì tiến hành thu mẫu lá để kiểm tra sự có mặt và hoạt động của gen chuyển crPrx.