Sơ đồ quy trình:
3.2. Giải thích quy trình. 3.2.1. Nguồn vật liệu.
Cây mẹ đang ở giai đoạn sinh trưởng mạnh nhất, cây sạch bệnh, cho năng xuất cao, chất lượng tốt, cây khỏe mạnh, không bị di dạng…
Được lựa chọn theo đơn đặt hàng của khách hàng. Tạo bộ sưu tập về giống theo các tiêu chí đẹp, có ích… Khôi phục giống có nguy cơ tuyệt chủng.
Loài có khả năng nhân giống hữu tính và vô tính khác không hiệu quả. Nhân nhanh với số lượng lớn trong một thời gian ngắn.
Mẫu lan denrobium thường được sử dụng vào mẫu gồm: đỉnh sinh trưởng
Mẫu Khử mẫu
Tạo cụm chồi
Huấn luyện cây Ra rễ và vươn thân
Tái sinh cây Tạo PLB Tạo chồi
Môi trường
3.2.2. Khử mẫu.
Mẫu đựng trong erlen, rửa bằng xà phòng loãng (lắc trong khoảng 5 phút, dùng bông gòn nhúng nước xà bông lau mẫu để loại bỏ bụi bẩn có kích thước lớn. vi khuẩn có kích thước lớn).
Để mẫu dưới vòi nước chảy 15-30 phút, nhằm rửa sạch xà bông trên bề mặt và bụi bẩn bám trên mẫu..
Khử trùng bình erlen bằng cồn, cho mẫu vào bình và chuyển vào tủ cấy. Nhằm loại bỏ bớt nguồn nhiễm có ở erlen cũ và chuyển vào tủ cấy cách ly với môi trường ô nhiễm bên ngoài.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần. loại bỏ bớt bụi bẩn và vi khuẩn. Khử trùng bằng cồn 700, trong 1 phút tác dụng khử trùng mặt ngoài của mẫu. Bước này nhằm khử trùng ở bề mặt ngoài của mẫu, nhưng vì cồn có tính phá mẫu nên cần hạn chế tối đa sự tiếp xúc với mẫu.
Rửa lại bằng nước cất 2-3 lần( rửa sạch cồn bám trên mẫu). Chuyển qua erlen vô trùng mới
Khử trùng bằng javen 50% + 2-3 giọt tween 80, trong 20 phút. Tween 80 giảm sức căng bề mặt, hỗ trợ javen khử trùng sâu bên trong mẫu. 20 phút vừa đủ để khử trùng mẫu, thời gian lâu quá sẽ ảnh hưởng không tốt cho mẫu gây chết mẫu hoặc tồn thương mẫu.
Rửa lại bằng nước cất cho sạch javen.
Mẫu
Khử trùng bằng Javen 50%, 20 phút Rửa bằng xà phòng
loảng
Rửa dưới vòi nước chảy
Rửa lại bằng nước cất vô trùng
Rửa bằng nước cất vô trùng
Khử trùng bằng Hgcl2
1‰, trong 4 phút.
Rửa lại bằng nước cất vô trùng
Khử trùng bằng cồn 700, 1 phút Rửa lại bằng nước cất
Chuyển mẫu ra dĩa, cắt lớp màng bao bọc ngoài mầm( giúp khử trùng tốt hơn)
Đưa mẫu vào bình erlen. Tiếp tục khử trùng bằng Hgcl2 1‰, trong 4 phút. Hgcl2 tuy độc nhưng khử trùng tốt và không phá mẫu. tuy vậy không nên để lâu làm Hgcl2 ngấm vào mẫu gây độc.
Rửa lại bằng nước cất cho sạch Hgcl2.
Đưa mẫu lên dĩa cắt mâu, mẫu cắt dài 1cm trên mắt 0.5 và dưới 0.5. ta lấy mắt để tạo chồi nên không cần mẫu quá dài để tiết kiệm diện tích, cũng không được quá ngắn làm ảnh hưởng tới sự phát triển của chồi sau này. Chuyển mẫu vào môi trường cấy.
Đặc biệt cần chú ý: các thao tác từ khi chuyển mẫu vào tủ cấy và thao tác phải tuyệt đối vô trùng.
3.2.3. Tạo chồi.
Hình 3.1: Chồi.
Mẫu sau khi khử trùng được cấy vào môi trường tạo chồi. Chồi được tạo ra từ mắt ngủ hoặc đỉnh sinh trưởng, dưới ảnh hưởng của cytokinin nồng độ cao. ở nhiệt độ 250C
Thời gian nuôi cấy: 2 tháng
Hình 3.2: PLB.
Chồi được 2 tuần tuổi tiến hành cắt đỉnh sinh trưởng và cấy vào môi trường tạo PLB. Giai đoạn này hủy đỉnh sinh trưởng để kích thích chồi bên phát triển dưới tác dụng của citokinin.
Tùy theo số lượng đặt ra có thể có thêm giai đoạn tăng sinh PLB để tăng số lượng PLB.
Thời gian nuôi cấy: 2.5 - 3 tháng.
3.2.5. Tạo cụm chồi.
Hình 3.3: Cụm chồi.
Mẫu PLB đạt yêu cầu, tách nhỏ mẫu cấy chuyền qua môi trường tạo cụm chồi, tùy theo số lượng có thể thêm giai đoạn tăng sinh cụm chồi.
Thời gian nuôi cấy: 2 - 2.5 tháng.
Hình 3.4: Cây tái sinh.
Từ cụm chồi dưới ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng kích thích chồi phân hóa phát triển thành cây. Từ giai đoạn này trở đi nhu cầu dinh dưỡng của cây giảm.
Thời gian nuôi cấy: 2-2.5 tháng.
3.2.7. Tạo rễ.
Hình 3.5: Tạo rễ cây.
Cây con sau khi tái sinh cây được chuyển vào môi trường tạo rễ. giai đoạn này kích thích cây ra rễ và kéo dài thân, tăng chiều cao.
Thời gian: 3 tháng.
Hình 3.6: Giai đoạn huấn luyện cây.
Đưa cây ra khỏi phòng nuôi cấy ra ngoài, giúp cây thích nghi dần với điều kiện tự nhiên trước khi trở thành cây giống. Các bình nuôi cấy chứa cây con sẽ được đặt lên các giàn, đặt nơi thoáng khí, tiếp xúc với ánh sáng tự nhiên. Thời gian nuôi cấy: 2 tuần.
3.2.9. Cây giống.
Sau khi kết thúc thời gian huấn luyện, cây con sẽ được lấy ra khỏi bình nuôi cấy, rửa sạch agar, chất dinh dưỡng và rễ, lá thối khỏi cây trước khi đưa ra vườn ươm hoặc giao cho khách hàng.
CHƯƠNG 4: KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VÀ KHÁC PHỤC SỰ CỐ