Hiện nay, Chitosan đã được ứng dụng rất nhiều vào các lĩnh vực của cuộc sống cho nên nhu cầu về Chitosan là rất lớn. Có rất nhiều cơ sở sản xuất được xây dựng để sản xuất Chitosan theo các quy trình khác nhau để cung cấp cho thị trường, tuy nhiên chỉ có một lượng ít các cơ sở có sản phẩm Chitosan có chất lượng đáp ứng được yêu cầu. Chitosan sản xuất tại các cơ sở sản xuất trên có thể chỉ an toàn đối với việc sử dụng trong các lĩnh vực công nghệ thực phẩm, công nghệ xử lý nước thải trong công nghiệp, nông nghiệp… còn nếu áp dụng trong lĩnh vực y tế thì sẽ gây ra các phản ứng phụ bởi Chitosan có hàm lượng protein và hàm lượng kim loại (hàm lượng kim loại nằm trong khoảng 70-80 ppm, hàm lượng kim loại nặng 7.5 ppm) cao hơn so với quy định.
Do vậy, việc nghiên cứu ứng dụng quy trình tinh chế Chitosan nhằm nâng cao chất lượng của Chitosan thành phẩm hứa hẹn sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới. Chitosan sau khi tinh chế có chất lượng tốt hơn rất nhiều so với ban đầu: Hàm lượng protein chỉ còn <0.2%, hàm lượng tro <0.01%, hàm lượng kim loại <5ppm. Chitosan sau khi tinh chế có thể áp dụng trực tiếp vào các nghành công nghệ thực phẩm, nông nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực y học, thiết bị y học, công nghệ xử lý nước trong công nghiệp…
Như ta đã biết, Chitin là một hợp chất có màu trắng, không hòa tan trong nước, kiềm, acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu…Còn Chitosan là một hợp chất màu trắng, không hòa tan trong kiềm, nước nhưng lại tan dễ dàng trong dung dịch acid loãng (pH =6.5). Khi Chitosan hòa tan trong dung dịch acid loãng sẽ tạo thành một dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo Chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như Pb3+, Hg2+.
Lợi dụng tính chất hóa lý khác nhau này, để tinh chế Chitosan ta hòa tan Chitosan vào dung dịch acid loãng. Sau đó lại kết tủa lượng Chitosan đã hòa tan bằng dung dịch NaOH (4%), rồi lọc thu được lượng Chitosan trên. Sau khi thu được tủa rồi tiến hành rửa trung tính bằng nước thường, nước cất. Mặt khác, trong quá trình tinh chế thì pH cũng ảnh hưởng đến quá trình khử khoáng, protein.
Chitosan sau khi tinh chế sẽ loại bỏ đi một lượng đáng kể các chất màu, endotoxins, protein ở dạng liên kết như glycoprotein và khoáng chất, vi sinh vật…từ đó nâng cao được chất lượng của sản phẩm.
Chương II: Đối Tượng Và Phương
II.1 Đối tượng nghiên cứu II.1.1 Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là Chitosan được chiết tách từ vỏ tôm sú sau khi đã qua công đoạn khử khoáng bằng acid và khử protein, deacetyl hóa bằng NaOH đậm đặc.
Chitosan nghiên cứu được cung cấp bởi Trung Tâm Chế Biến - Trường Đại Học Nha Trang. Sơ bộ quy trình sản xuất như sau:
Nguyên liệu sau khi thu mua từ các nhà máy chế biến thủy sản thuộc tỉnh khánh hòa như: F17, F90. Sau đó, rửa sạch để loại bỏ những tạp chất có lẫn trong nguyên liệu.
Sau đó được ngâm trong acid với nồng độ acid HCl 7% trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ nguyên liệu/ dung dịch ngâm là 1/5. Sau đó, rửa trung tính để loại bỏ hết acid trước khi ngâm vào NaOH.
Khử protein: sau khi rửa trung tính, tiến hành ngâm vào NaOH để khử protein với nồng độ NaOH 6% trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ bán thành phẩm/dung dịch ngâm là 1/5.
Sau khi tiến hành rửa trung tính loại bỏ hết NaOH thì thu được Chitin đem phơi nắng. Rồi ngâm trong NaOH với nồng độ 70% trong 3 ngày, ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ Chitin/dung dịch là 1/15.
Sau đó tiến hành rửa nhiều lần bằng nước sạch cho tới khi hết NaOH. Rồi phơi khô thu được Chitosan dạng vẩy, có màu trắng ngà.
II.1.2 Hóa chất
- Hydroxyl Natri (NaOH): Là một bazơ mạnh. Trong thí nghiệm, dùng NaOH ở dạng tinh khiết, dùng để kết tủa Chitosan sau khi đã hòa tan vào acid acetic và acid citric.
- Acid Acetic (CH3COOH): Là một acid hữu cơ có mùi sốc, dạng lỏng hòa tan trong nước và có tính bay hơi nhanh. Trong thí nghiệm, dùng CH3COOH để hòa tan Chitosan.
- Acid Citric: Là một aicd hữu cơ, không độc. Trong thí nghiệm, dùng acid citric ở dạng tinh thể, tinh khiết và để hòa tan Chitosan.
- Cồn: Trong thí nghiệm, dùng cồn tinh khiết để tách nước của Chitosan sau khi qua bước rửa trung tính.
II.2 Phương pháp nghiên cứu II.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng độ acid thích hợp Với acid acetic:
Chitosan thô
Hòa tan vào acid acetic với các nồng độ 0.5%, 1%, 1.5%, 2%.
Kiểm tra độ hòa tan
Chọn nồng độ thích hợp.
Hình 2-1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng
Với acid citric:
Chitosan thô
Hòa tan vào acid citric với các nồng độ 3%, 4%, 5%, 6%.
Kiểm tra độ hòa tan
Chọn nồng độ thích hợp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2-2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nồng
Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình tinh chế Chitosan
Hình 2-3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình
tinh sạch Chitosan
NaOH 4%, 1/5 h, to phòng tỷ lệ: 1: 1 (v/v)
Rửa bằng nước thường (6 lần, w/v = 1: 50, t = 1/4h, to phòng )
Hòa tan vào acid acetic, citric (to phòng, 1/4h, nồng độ thích hợp)
Lọc/ loại bỏ phần không tan
Kết tủa bằng NaOH 4%
Lọc/ thu tủa Chitosan thô
Rửa trung tính (bằng nước thường và nước cất)
Ngâm trong nước cất trong 8h
Rửa lại bằng cồn
Phơi khô - Chitosan tinh sạch
Rửa bằng nước cất (3 lần, w/v = 1: 50, t = 1/4h, to phòng )
Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra chất lượng Chitosan
Hình 2- 4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra
chất lượng Chitosan
II.2.2 Các phương pháp kiểm tra chất lượng Chitosan
Hiện nay, ở nước ta chưa có một hệ thống chỉ tiêu đánh gia chất lượng của Chitosan. Các chỉ tiêu nêu ra dưới đây là những chỉ tiêu mà em thu thập từ những tài liệu trong nước và ngoài nước nhằm góp phần xây dựng một hệ thống chỉ tiêu hoàn chỉnh cho sản phẩm Chitosan.
Phương pháp cảm quan và màu sắc trạng thái
- Đưa Chitosan lên tờ giấy trắng, phân tích về màu sắc, trạng thái của Chitosan.
- Dùng tay để thử độ mềm mại của Chitosan. Xác định độ ẩm
- Cách tiến hành: Sấy cốc đến trọng lượng không đổi ở nhiệt độ 105oC, cân trên phân tích (sai số 10-3 g).
Cho vào cốc khoảng 3 – 5 g Chitosan, cân tất cả trên cân phân tích có độ chính xác như trên. Sau đó lại cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC, sấy đến
Chitosan thô – Chitosan tinh sạch
Xác định chất lượng Chitosan
Đánh giá
cảm quan Xác định độ ẩm Xác định hàm lượng tro Xác định hàm lượng protein Xác định độ nhớt KT tổng VSV
trọng lượng không đổi, thời gian 16h, sấy xong đem làm nguội ở bình hút ẩm và cân trên cân phân tích. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tính kết quả % 100 1 2 1 G G G G X Trong đó: X: Hàm lượng ẩm (%) G : Trọng lượng cốc (g)
G1: Trọng lượng cốc + Chitosan trước khi sấy (g) G2: Trọng lượng cốc + Chitosan sau khi sấy (g) Xác định hàm lượng tro
- Cách tiến hành: Cốc sứ đã rửa sạch cho vào tủ nung tới 550oC đến trọng lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích có độ chính xác 10-3 g. Cho vào cốc sứ đã nung khoảng 2g Chitosan, cân tất cả trên cân phân tích có độ chính xác như trên. Cho cốc Chitosan hóa tro đen ở bếp điện trong tủ Host, đến khi thành tro đen, cho vào nung ở nhiệt độ 550oC, nung đên tro trắng, thời gian khoảng 16h, để nguội trong bình hút ẩm và cân đến trọng lượng không đổi. Tiếp tục nung lại rồi để nguội trong bình hút ẩm và cân đến trọng lượng không đổi.
- Tính kết quả % 100 1 2 G G G G X Trong đó: X: Hàm lượng tro (%) G: Trọng lượng cốc (g) G1: Trọng lượng cốc + Chitosan (g)
G2: Trọng lượng cốc + tro (g)
Phương pháp tính hiệu suất khử khoáng, khử protein
Phương pháp tính hiệu suất khử khoáng: Đầu tiên xác định hàm
lượng khoáng có trong mẫu Chitosan ban đầu và hàm lượng khoáng có trong mẫu Chitosan đã qua tinh sạch. Sau đó tính kết quả theo công thức sau:
Trong đó:
X: Là hiệu suất khử khoáng (%)
X1: Là hàm lượng tro của mẫu Chitosan thô (%)
2
X : Là hàm lượng tro của mẫu Chitosan tinh sạch (%)
Phương pháp tính hiệu suất khử protein: Đầu tiên xác định hàm
lượng protein có trong mẫu Chitosan ban đầu và hàm lượng protein có trong mẫu Chitosan đã qua tinh sạch. Sau đó tính kết quả theo công thức sau:
100 * 1 2 1 G G G G Trong đó:
G: Là hiệu suất khử khoáng (%)
1
G : Là hàm lượng tro của mẫu Chitosan thô (%)
2
G : Là hàm lượng tro của mẫu Chitosan tinh sạch (%) Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
- Nguyên tắc: Vi sinh vật hiếu khí là những vi sinh gây hư hỏng thực
phẩm chỉ sống được trong điều kiện có oxy tự do.
Tổng số vi sinh vật hiếu khí được xác định theo phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch để ở 37 oC sau 24 giờ.
Môi trường nuôi cấy: Thạch thường.
100 * 1 2 1 X X X X
- Tiến hành thử: Nhỏ 1ml dung dịch mẫu thử có nồng độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa petri. Dùng 2 đĩa cho mỗi nồng độ, dùng 3 nồng độ thích hợp pha kế nhau cho 1 mẫu.
Cho khoảng 15 – 20 ml môi trường đã hấp vô trùng và được làm nguội đến 40 – 45 oC vào mỗi đĩa trong vòng 15 phút từ khi cấy mẫu. Trộn đều bằng cách lắc tròn đĩa theo chiều xuôi và ngược với chiều quay của kim đồng hồ, mỗi chiều 5 vòng. Sau khi môi trường đông thì lật ngược đĩa để trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
- Đọc kết quả: Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc thích hợp. Dùng mắt thường hoặc qua một kính lúp có độ phóng đại 2 – 3 lần để đếm khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri đó. Sau đó nhân số khuẩn lạc đếm được trên mỗi đĩa với số lần pha loãng tương ứng. Giá trị trung bình cộng của số khuẩn lạc tính từ các công thức pha loãng của cùng một mẫu được xác định là tổng số vi sinh vật hiếm khí có trên 1 gam mẫu đó.
A=N/n1Vf1+….+ nifiV A: Số tế bào trong 1 gam mẫu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đã chọn ni: Số lượng đĩa đã chọn tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dung dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng
Xác định độ nhớt của Chitosan
- Phương pháp: Pha Chitosan nồng độ 1% trong acid acetic 1%, sau đó
tiền hành đo độ nhớt của dung dịch ở nhiệt độ 25 OC bằng máy đo NDJI, sử dụng roto số 2. Kết quả đo được xác định bằng công thức sau:
k
Trong đó:
: Kết quả đọc được trên cửa sổ của nhớt kế k : Hệ số tỷ lệ được tra theo bảng sau
rpm Roto 60 30 12 6 0 0.1 0.2 0.5 1 1 1 2 5 10 2 5 10 25 50 3 20 40 100 200 4 100 200 500 1000
- Tiến hành đo: Mẫu được đo ở roto số 2 và ở 60 rpm. Xác định độ hòa tan
- Nguyên lý: Chitosan được hòa tan trong acid acetic, còn các hợp chất khác không hòa tan.
- Tiến hành: Cân chính xác m (g) Chitosan, rồi hòa tan trong acid actic
1% với nồng độ 1%, khuấy đều trong 30 phút để cho Chitosan tan hoàn toàn. Sau đó đem lọc qua giấy lọc, rồi rửa lại bằng nước cất, đem sấy khô đến khối lượng không đổi ta xác định được độ tan của Chitosan.
- Tính kết quả: Công thức tính hàm lượng chất không tan
% 100 * m B A X Trong đó:
A: Là khối lượng giấy lọc và bã lọc sau khi sấy khô (g) B: Là khối lượng giấy lọc trước khi lọc đã sấy khô (g)
m: Là khối lượng mẫu Chitosan đã sử dụng (g)
Xác định hàm lượng protein: Xác định bằng phương pháp kjeldahl
- Nguyên lý: Vô cơ hóa mẫu để chuyển Nitơ trong mẫu về dạng (NH4)2SO4 bền vững. Sau đó sục kiềm đặc để đẩy Nitơ ở dạng (NH4)2SO4 về dạng NH3 bằng H2SO4 tiêu chuẩn, lượng H2SO4 tiêu chuẩn dư được xác định là kiềm tiêu chuẩn với chỉ thị là metyl đỏ 0.1%.
- Tiến hành: Cân 1 kg Chitosan cho vào bình kjeldahl lấy 10 ml H2SO4 đậm đặc, thêm 5g hỗn hợp xúc tác CuSO4/ K2SO4 vào tiến hành vô cơ hóa mẫu. Khi dung dịch không màu (xanh trong cũng được), hết khói thì quá trình vô cơ hóa mẫu đã kết thúc. Lúc này trong bình là (NH4)2SO4.
Chú ý: Nếu dung dịch chưa trong mà đã cạn thì lấy ra để nguội và thêm vài ml H2SO4 đậm đặc rồi tiếp tục vô cơ hóa cho đến khi không màu.
Sau khi vô cơ hóa xong để nguội và dùng nước cất pha loãng thành 250 ml ở bình định mức 250 ml. Lấy 10 ml dung dịch H2SO4 0.1N và 5 giọt metyl đỏ 0.1 % vào cốc hứng 250 ml đặt dưới đầu ống sinh hàn. Lấy 10 ml mẫu đã pha loãng cho vào bình chưng cất của thiết bị, cho vài giọt phenolphtalein 1% và cho từ từ dung dịch NaOH 35% đến khi chuyển thành màu đỏ.
Tiến hành chưng cất khoảng 20 phút rồi thử bằng giấy đo pH khi pH = 7 thì dừng.
Dùng NaOH 0.1 N chuẩn độ dung dịch trong cốc hứng đến khi dung dịch chuyển từ màu đỏ sang màu vàng thì dừng lại.
- Tính kết quả m F b a NTQ ( )0.0014 100 Trong đó: a: Số ml H2SO4 0.1 N dùng trong cốc hứng b: Số ml NaOH 0.1 N dùng trong chuẩn độ
F: Hệ số pha loãng m: Trọng lượng mẫu
0.0014 : Số g Nitơ tương đương với 1 ml H2SO4
Muốn tính lượng protein trong mẫu, ta phải nhân kết quả Nitơ toàn phần với 6.25.
Chương III:Kết Quả Nghiên Cứu Và Thảo Luận
III.1 Kết quả kiểm tra chất lượng Chitosan thô
Mẫu Chitosan thô đem đi tinh sạch được sản xuất tại Trung Tâm Chế Biến - Trường Đại Học Nha Trang với các chỉ tiêu chất lượng như sau: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu chất lượng của Chitosan thô được sản xuất tại Trung
Tâm Chế Biến – Trường Đại Học Nha Trang
Các chỉ tiêu Chitosan thô
Màu sắc Trắng ngà Hàm lượng ẩm (%) 13.9 Hàm lượng tro (%) 2.72 Hàm lượng protein (%) 1.74 Độ nhớt (centipoise) 525 Độ hòa tan (%) 94.7 Tổng số vsv hiếu khí (cfu/g) 30 Thảo Luận:
Qua bảng 3.1 nhận thấy rằng: Mặc dù thời gian sản xuất khá dài nhưng Chitosan có chất lượng chưa cao. Hàm lượng tro và protein còn lại tương đối cao. Do thời gian xử lý dài và nồng độ hóa chất sử dụng cao nên độ nhớt của Chitosan không cao.
Chitosan, sản xuất tại Trung Tâm Chế Biến Trường Đại Học Nha Trang nói riêng và các cơ sở sản xuất khác nói chung vẫn chưa khử được hàm lượng khoáng, protein xuống mức cần thiết, trong khi đó độ nhớt của Chitosan lại thấp. Do vậy, Chitosan cần phải tinh sạch để đáp ứng được yêu cầu cao hơn của sản xuất.
III.2 Kết quả xác định nồng độ acid thích hợp để hòa tan Chitosan
Để tinh sạch Chitosan, trước hết phải chọn được dung môi và nồng độ thích hợp để hòa tan nó. Do vậy việc chọn nồng độ acid thích hợp là yêu cầu bắt buộc trong quy trình tinh sạch Chitosan.
Đối với acid acetic:
Tiến hành xác định nồng độ acid acetic thích hợp theo sơ đồ bố trí thí nghiệm [hình 2-1] thu được kết quả sau:
Bảng 3.2: Độ hòa tan của Chitosan trong acid acetic ở các
nồng độ khác nhau
Thảo luận:
Qua bảng 3.2 nhận thấy rằng: Chitosan tan tốt trong dung dịch acid