a. Mục đích: Xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp để tồn trữ sản phẩm.
b. Phƣơng pháp thực hiện: Thí nghiệm gồm 2 nhân tố và 3 lần lặp lại.
- Nhân tố 1: Nhiệt độ tồn trữ có 3 mức độ: tủ lạnh (4 - 6ºC); phòng mát (20 - 25ºC) và nhiệt độ môi trường xung quanh (28 - 32ºC).
- Nhân tố 2: thời gian tồn trữ: 1, 2 và 3 tuần.
Các chỉ tiêu đánh giá
- Độ pH: đo bằng pH kế các chỉ tiêu trước và sau lên men
- Hàm lượng chất hoà tan (độ Brix): đo bằng Brix kế các chỉ tiêu trước và sau lên men
- Acid tổng số (qui ra acid lactic): Xác định hàm lượng acid sau lên men bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1N
- Mật số vi khuẩn acid lactic: Đếm sống sau khi lên men trên môi trường MRS agar
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và định danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic
Nguồn giống được chọn từ các loại bột men tiêu hóa bán trên thị trường và tiến hành phân lập trên môi trường MRS cho đến khi thuần. Tuy nhiên, bản thân nước thanh long vẫn có sự hiện diện của vi khuẩn acid lactic. Do đó, ngoài nguồn vi khuẩn acid lactic lấy từ bột men tiêu hóa còn phân lập thêm vi khuẩn acid lactic từ thanh long. Sở dĩ phân lập như vậy là để so sánh khả năng ứng dụng và chính nước thanh long lên men vào các nguồn giống thuần đã biết.
Qua nhiều lần cấy truyền trên môi trường MRS agar và quan sát bằng mắt thường cho thấy các khuẩn lạc có dạng tròn, bóng, màu trắng đục chứng tỏ đồng nhất về hình dạng khuẩn lạc. Các khuẩn lạc từ bột Antibio và bột Probio lớn hơn các khuẩn lạc từ nước thanh long.
Sau khi phân lập, thu được 6 dòng vi khuẩn (4 dòng từ 3 loại bột men tiêu hóa và 2 dòng vi khuẩn từ nước thanh long lên men tự nhiên). Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính X100 nhận thấy các dòng này có sự đồng nhất về hình dạng cho nên có thể nói các dòng vi khuẩn được phân lập đã thuần. Đặc điểm hình thái và nguồn gốc các dòng được phân lập được trình bày ở Bảng 3.
Bảng 3. Đặc điểm hình thái của các dòng vi khuẩn acid lactic
STT Nguồn phân lập Dòng phân lập Khuẩn lạc Tế bào
1 Thanh long TL1 Trắng đục, nhô cao, bề mặt trơn, bìa nguyên, kích thước lớn
Que 2 Thanh long TL2 Trắng đục, nhô thấp, bề mặt trơn, bìa
nguyên, kích thước lớn kết đôi Que 3* Sản phẩm men tiêu
hóa Antibio
A Trắng đục, bề mặt trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn 4* Sản phẩm men tiêu
hóa Probio
Pro Trắng đục, bề mặt trơn lồi, bìa nguyên Que ngắn 5* Sản phẩm men tiêu
hóa Lactomin plus
Lac Trắng đục, bề mặt trơn lồi, bìa nguyên Liên cầu 6* Sản phẩm men tiêu
hóa Biosubtyl
Bio Trắng đục, bề mặt trơn lồi, bìa chia thùy.
Que dài
Ghi chú: Các dòng có dấu * là dòng vi khuẩn từ Lương Phước Trường (2012)
- Dòng vi khuẩn phân lập được từ bột Antibio và Probio có một dạng hình que duy nhất, phù hợp với đặc điểm dòng vi khuẩn công bố là Lactobacillus acidophilus.
- Dòng vi khuẩn được phân lập từ bột Lactomin plus có dạng hình liên cầu. Cả 2 dòng vi khuẩn phân lập được từ nước thanh long lên men tự nhiên đều có dạng hình que. Tuy nhiên, vi khuẩn hình que này có chiều dài ngắn hơn chiều dài của vi khuẩn hình que được phân lập từ bột Antibio và từ bột Probio.
Để xác định các dòng vi khuẩn đã được phân lập thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic, tiến hành nhuộm Gram và thử nghiệm catalase các dòng vi khuẩn trên. Kết quả cho thấy:
- Tất cả các tế bào vi khuẩn đều bắt màu tím xanh của phần nhuộm crytal violet, chứng tỏ các dòng vi khuẩn này thuộc Gram dương.
- Khi cho và dung dịch H2O2 3%, cả 4 dòng vi khuẩn này đều không có hiện tượng sinh bọt khí hay catalase âm tính.
Qua các thử nghiệm trên, có thể kết luận các dòng vi khuẩn được phân lập thuộc nhóm vi khuẩn acid lactic dựa vào các đặc điểm sau:
- Là vi khuẩn Gram dương. - Không có enzyme catalase
- Có dạng hình que hay hình liên cầu - Phát triển được trên môi trường MRS
4.2. Khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic đƣợc phân lập
Để khảo sát khả năng ứng dụng của các dòng vi khuẩn vừa phân lập được để đưa vào sản phẩm probiotic, tiến hành thử khả năng tồn tại của các dòng vi khuẩn ở môi trường MRS có pH thấp. Chủng các dòng vi khuẩn và ống nghiệm chứa MRS với pH được hiệu chỉnh sẵn ở 1,5; 2,5 và 3,5 với tỉ lệ là 1 mL (5 log tế bào/mL) giống chủng + 9 mL môi trường. Như vậy nồng độ giống chủng ban đầu là 4 log tế bào/mL. Sau khi chủng giống vào môi trường tiến hành lấy mẫu để đếm sống ở thời điểm T0 bằng phương pháp đếm sống. Sau 2 giờ ủ ở 37ºC, tiến hành lấy mẫu đếm mật số vi khuẩn, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4. Mật số vi khuẩn trong môi MRS lỏng có pH thấp
pH Dòng Vi khuẩn T0 (Log CFU/mL) T2 (Log CFU/mL) 1,5 A 1,26 6,62 b Pro 1,08 6,48g
TL1 1,16 6,56c TL2 1,19 6,49g Bio 1,12 6,48g Lac 1,21 6,44i 2,5 A 1,40 6,48g Pro 1,37 6,40i TL1 1,36 6,55cd TL2 1,35 6,31k Bio 1,39 6,53def Lac 1,37 6,31k 3,5 A 3,44 6,53def Pro 3,58 6,66a TL1 3,34 6,54de TL2 3,37 6,46h Bio 3,36 6,45hi Lac 3,43 6,52f
Ghi chú: T0 -lúc mới chủng giống, T2- sau 2 giờ ủ. Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. "Các trị trung bình trong cùng một cột theo sau có các mẫu tự giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%."
Trong đó: A là dòng vi khuẩn được phân lập từ bột Antibio Pro là dòng vi khuẩn được phân lập từ bột Probio Bio là dòng vi khuẩn được phân lập từ bột Biosubtyl Lac là dòng vi khuẩn được phân lập từ bột Lactomin plus.
TL1 và TL2 là dòng vi khuẩn được phân lập từ nước thanh long. Sau 2 giờ ủ ở pH thấp, các vi khuẩn đều gia tăng mật số. Mật số vi khuẩn lúc đầu là 4 log tế bào/mL nhưng khi chủng vào môi trường MRS với pH trong khoảng 1,5 – 2,5 thì mật số của chúng giảm đi đáng kể (chỉ còn 1,08 – 1,40 log CFU/mL), nguyên nhân là do pH quá thấp cho nên đa số vi khuẩn bị sốc. Nhưng sau khi ủ chỉ trong 2 giờ ở 37ºC chúng lại phục hồi và gia tăng mật số (lên đến 6,31 – 6,62 log CFU/mL).
Ở pH 3,5, đa số vi khuẩn chịu được độ pH này cho nên mật số của chúng ở thời điểm T0 giảm đi không đáng kể (còn khoảng 3,34 – 3,58 log CFU/mL), giảm không nhiều so với mật số lúc ban đầu. Sau 2 giờ ủ, chúng đã gia tăng mật số đến 6,45 - 6,66 log CFU/mL.
Kết quả cho thấy mật số của 6 dòng vi khuẩn ở thời điểm T0 trong môi trường ở pH 3,5 đều cao hơn ở pH 2,5 và mật số của chúng ở pH 2,5 lại cao hơn ở pH 1,5. Điều này chứng tỏ pH càng thấp càng ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của vi khuẩn acid lactic.
Tất cả 6 dòng vi khuẩn acid lactic sau 2 giờ ủ ở 3 mức độ pH khác nhau đều có sự gia tăng mật số và đều đạt mức độ tương đối như nhau, dao động trong khoảng 6,31 – 6,66 log CFU/mL).
Kết quả xử lý thống kê cho thấy mật số của các dòng vi khuẩn sau 2 giờ ủ ở 3 thì sự gia tăng mật số của các dòng vi khuẩn ở các mức độ pH khác nhau là khác biệt có ý nghĩa với nhau với độ tin cậy 95% (Bảng PL4). Trong đó, dòng Pro ở pH 3,5 đạt mật số cao nhất (6,66 log CFU/mL), kế đến là dòng A ở độ pH 1,5 (6,62 log CFU/mL) và ở môi trường pH 2,5 là dòng TL1 (6,55 log CFU/mL).
Sau 2 giờ ủ ở 3 mức độ pH khác nhau thì tất cả 6 dòng vi khuẩn acid lactic đều có sự gia tăng mật số. Qua xử lý thống kê thì mật số vi khuẩn ở các nghiệm thức khác biệt không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95%.
Qua thí nghiệm khảo sát này cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đã được phân lập đều có thể thích nghi và phát triển được trên môi trường có độ pH thấp, cho nên chúng có thể chịu được môi trường trong dạ dày người. Do đó, các dòng vi khuẩn này đều có khả năng ứng dụng vào trong sản phẩm probiotic.
4.3. Khả năng lên men nƣớc thanh long bằng vi khuẩn acid lactic
Hiện nay, các sản phẩm probiotic thường được sử dụng là dạng sữa lên men và yougurt. Tuy nhiên, tính không dung nạp lactose và hàm lượng cholesterol là 2 trở ngại liên quan đến người tiêu dùng. Từ đó, nước trái cây được đề nghị là một môi trường tốt cho sự lên men tạo ra các sản phẩm probiotic (Mattila-Sandhlm et al., 2002). Nước trái cây chứ nhiều thành phần dinh dưỡng và không chứ chất gây dị ứng cho người tiêu dùng. Với những giá trị dinh dưỡng cao, nước thanh long được công nhận là một trong những thức uống tốt cho sức khỏe.
Để xác định các dòng vi khuẩn acid lactic đã được phân lập có thể ứng dụng trong sản xuất nước thanh long lên men để tạo thành sản phẩm probiotic và để so sánh khả năng ứng dụng của cá dòng vi khuẩn acid lactic này với nhau, tiến hành cho lên men thanh long bằng các dòng vi khuẩn này.
Thanh long được ép lấy nước có độ Brix là 8,9 và pH là 4,52 được phân phối trong các tuýp ly tâm 50 mL, mỗi tuýp chứa 36 mL nước thanh long đã thanh trùng bằng NaHSO3 (140 mg/L trong 20 phút). Chủng các dòng vi khuẩn vào mỗi tuýp chứa 36 mL nước thanh long với 4 mL (5 log tế bào/mL) giống chủng, do đó nồng độ giống chủng ban đầu của tất cả các mẫu đều là 4 log tế bào/mL
Sau khi chủng giống, tiến hành đếm mật số vi khuẩn acid lactic ở thời điểm T0 và sau 48 giờ ủ ở 37ºC bằng phương pháp đếm sống và đo các chỉ tiêu như độ Brix, pH và hàm lượng acid sinh ra, kết quả được trình bày ở Bảng 5.
Tất cả các dòng vi khuẩn acid lactic sau 48 giờ lên men nước thanh long đều có sự gia tăng mật số, giảm hàm lượng chất hòa tan (độ Brix), sản sinh ra acid lactic và làm giảm pH của môi trường.
Độ Brix của các nghiệm thức sau lên men đều giảm so với ban đầu mực dù không đáng kể, từ 8,9ºBrix xuống khoảng 7,1 – 8,0ºBrix, nguyên nhân là do vi khuẩn lactic đã sử dụng đường có sẵn trong nước thanh long để tăng sinh khối và tạo acid lactic thải ra môi trường. Kết quả thống kê cho thấy sự giảm độ Brix của các dòng vi khuẩn acid lactic khác biệt ý nghĩa không nhiều.
Bảng 5. Một số chỉ tiêu sau lên men nƣớc thanh long
Dòng vi khuẩn Độ Brix pH Acid (% w/v) Log T0 (log CFU/mL) Log T48 (log CFU/mL) A 8,0 4,31 1,38a 3,86ab 8,44a Pro 7,5 3,23 1,36b 3,84c 8,36b TL1 7,1 4,01 1,28c 3,82d 8,35bc TL2 7,9 3,95 1,24d 3,85bc 8,34c Bio 8,0 4,25 1,19e 3,87a 8,37b Lac 7,8 4,09 1,23d 3,84c 8,27d
Ghi chú: Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%.
Sau 48 giờ lên men, pH môi trường đều giảm, từ 4,52 xuống còn khoảng 3,23 - 4,31. Ở khoảng pH này, vi khuẩn acid lactic vẫn còn khả năng sống sót như đã trình bày ở trên.
Nguyên nhân của sự giảm pH là do quá trình phát triển của vi khuẩn đã sinh ra acid lactic. Hàm lượng acid lactic sinh ra từ 2 dòng vi khuẩn A (1,38% w/v) và Pro (1,36% w/v) cao hơnvà khác biệt ý nghĩa với độ tin cậy 95% so với các dòng phân lập
từ thanh long (TL1 và TL2; 1,28% và 1,24% w/v) và 2 dòng Lac và Bio và (lần lượt là 1,23% và 1,19% w/v) (Bảng PL5).
Mật số của các dòng vi khuẩn acid lactic ở thời điểm T0 đều gần bằng với nồng độ giống chủng ban đầu (3,82 - 3,87 log CFU/mL) và sau khi ủ tất cả chúng đều hoạt động tăng sinh khối đáng kể (8,27 - 8,44 log CFU/mL). Kết quả xử lý thống kê cho thấy ở thời điểm T0 mật số của dòng Bio và A là cao nhất (3,87 và 3,86 log CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa với so với các dòng còn lại với độ tin cậy 95% (Bảng PL 6).
Mật số của các dòng vi khuẩn sau 48 giờ lên men đều lớn hơn 6 log CFU/mL, phù hợp với tiêu chuẩn của sản phẩm probiotic cho nên các dòng này đều có khả năng ứng dụng trong sản xuất nước thanh long lên men. Trong đó dòng A đạt mật số cao nhất (8,44 log CFU/mL) và khác biệt ý nghĩa so với tất cả các dòng còn lại (Bảng PL7).
Từ các kết quả trên cho thấy dòng vi khuẩn A được phân lập từ bột men tiêu hóa Antibio có khả năng lên men sinh acid cao (1,38% w/v) và mật số sau lên men 48 giờ đạt đến 8,44 log CFU/mL là dòng vi khuẩn có các đặc tính tốt nhất có thể được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm trong qui trình lên men nước thanh long. Như đã thảo luận ở phần đầu, thành phần vi khuẩn của bột Antibio chỉ có duy nhất là Lactobacillus acidophillus. Kết quả khảo sát các đặc tính hình thái cho thấy đã phân lập được dòng
Lactobacillus acidophillus và đây là dòng vi khuẩn được ứng dụng nhiều trong các sản phẩm lên men từ vi khuẩn acid lactic
4.4. Tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và tỷ lệ phối chế đƣờng saccharose
Bảng 6 thể hiện các chỉ tiêu về pH và độ Brix của các nghiệm thức bố trí tỉ lệ nước thanh long (pha loãng với nước cất) và tỉ lệ phối chế đường saccharose sau 48 giờ lên men với dòng Lactobacillus acidophillus phân lập từ bột men tiêu hóa Antibio. Giá trị pH sau 48 giờ ủ đã giảm từ 4,35 - 4,42 xuống còn 3,69 - 4,0 là do vi khuẩn phát triển, chuyển hóa đường thành acid lactic. Đồng thời, hàm lượng chất hòa tan (độ Brix) cũng giảm nhưng không đáng kể.
Bảng 6. Giá trị pH và độ Brix của các tỉ lệ nƣớc thanh long và phối chế đƣờng Nghiệm thức Dạng nƣớc thanh long Tỉ lệ đƣờng (%) pH Độ Brix Trƣớc lên men Sau lên men Trƣớc lên men Sau lên men 1 Nước ép 6 4,35 3,73 12,4 12,0
2 nguyên chất 9 3,72 19,1 18,5 3 12 3,80 17,4 16,8 4 15 3,71 17,5 17,0 1 Mẫu xay + 20% nước 6 4,42 3,72 11,6 11,0 2 9 3,77 14,9 14,0 3 12 3,78 17,8 17,0 4 15 3,75 19,4 19,0 1 Mẫu xay + 40% nước 6 4,35 3,69 11,5 11,0 2 9 4,00 14,1 13,5 3 12 3,73 15,6 15,0 4 15 3,87 19,7 19,1 1 Mẫu xay + 60% nước 6 4,36 3,81 10,8 10,1 2 9 3,74 13,6 12,8 3 12 3,74 16,4 16,0 4 15 3,94 17,6 17,0
Ghi chú: các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại.
Kết quả ở Hình 5 cho thấy ở cùng một dạng phối chế nước thanh long, hàm lượng acid giảm khi nồng độ đường tăng. Hàm lượng acid đạt giá trị cao nhất ở nồng độ đường 6% và thấp nhất ở nồng độ đường 15%. Nguyên nhân là do nồng độ đường cao có thể ức chế khả năng phát triển và chuyển hóa của vi khuẩn acid lactic. Bên cạnh đó, ở cùng một nồng độ đường thì hàm lượng acid được sinh ra giữa các mẫu cũng có sự khác biệt. Đặc biệt, mẫu ép có hàm lượng acid nhiều nhất cho thấy nước ép là môi trường vi khuẩn phát triển tốt hơn các dạng khác.
Hình 5: Sự thay đổi hàm lƣợng acid theo dạng nƣớc thanh long và nồng độ đƣờng
Hình 6. Sự thay đổi mật số vi khuẩn theo dạng dịch thanh long và nồng độ đƣờng
Hình 6 cho thấy ở các dạng mẫu xay và phối chế với nước có mật số vi khuẩn giảm khi nồng độ đường tăng, nồng độ đường 12 – 15% có mật số vi khuẩn thấp hơn khi chỉ bổ sung 9% đường. Tương tự như trên, có thể với hàm lượng đường ban đầu