* Mô tả đặc điểm dược liệu.
- Hoàng Liên
Thân rễ HL thu hái từ Sapa cong queo dài 5 - 7cm, đường kính trung bình 0,3 - 0,5cm, có nhiều rễ phụ, nhỏ, cứng. Thể chất cứng, khi bẻ vết bẻ không phẳng. Vỏ rễ màu vàng nâu nhạt, bên trong màu vàng, vị rất đắng tồn tại lâu trong miệng, không mùi ( hình 4, hình 5 ).
Thân rễ HL mua ở Lãn Ông dài 4 - 6cm, đường kính trung bình 0,5 -0,7cm, phân nhánh. Vỏ mầu vàng nâu, bên trong mầu vàng đậm. Thể chất cứng, khi bẻ vết bẻ không phẳng. Vị rất đắng tồn tại lâu trong miệng ị hình5).
- Hoàng Bá
Vỏ HB có chiều dài không đồng nhất, dày 3 - 4mm. Mặt ngoài màu vàng lục có vết rãnh dọc, bần sót lại màu vàng. Mặt trong màu vàng sáng. Thể chất cứng, vết bẻ xơ, màu vàng tươi. Dược liệu gần như không mùi, vị đắng.(hình4)
- Hoàng Cầm
Đầu trên to dưới nhỏ, có vết tích rễ con, có thớ vặn, chiều dài 8 - 20cm, đường kính trung bình 1 - 2,5cm. Mặt ngoài màu vàng thẫm. Thể chất dòn, dễ bẻ. Mặt bẻ màu vàng, giữa có lõi màu nâu ( hình 4).
Hình 4: Bài thuốc THT Hình 5: HL Sapa và HL thị trường
* Đặc điểm bột.
- Bột Hoàng Liên
Bột HL màu vàng, vị rất đắng. Soi kính hiển vi thấy: tế bào mô mềm chứa tinh bột; tế bào mô cứng màu vàng; hạt tinh bột hình trứng hoặc hình bầu dục; mảnh bần màu nâu; sợi màu vàng sẫm có thành dày đứng riêng rẽ hoặc tụ với nhau thành từng bó; mảng mạch màu nâu ( hình 8 ).
- Bột Hoàng Bá
Bột HB màu vàng lục, dưới đèn tử ngoại có huỳnh quang màu vàng sáng, vị rất đắng. Soi kính hiển vi thấy: đám sợi màu vàng có vách rất dày; sợi chứa tinh thể canxioxalat hình lập phương; tế bào mô cứng màu vàng tươi đứng riêng rẽ hoặc tụ tập thành từng đám; tinh bột hình cầu nhỏ ( hình 6 ).
- Bột Hoàng Cầm
Bột HC màu vàng, vị đắng. Soi kính hiển vi thấy: mô mềm chứa tinh bột; các hạt tinh bột kép đôi, kép ba; sợi hình thoi đứng riêng rẽ hoặc tụ với nhau thành từng bó; tế bào mô cứng có thành dày; mạng chấm và mạng điểm ( hình 7 ).
4. Tế bào mô cứng. 2. Tinh thể canxioxalat
Hình lập phương. 3. Tinh bột.
1. Sợi và bó sợi chứa Tinh thể canxioxalat hình lập phương.
1. Mạch mạng. 2. Mạch điểm. 3. Tế bào mô cứng. 4. Bó sợi.
5. Mô mềm chứa tinh bột. 6. Tinh bột. Hình 7: Đặc điểm bột Hoàng Cầm 1. Mảnh mô mềm chứa tinh bột. 2. Hạt tinh bột. 3. Mảnh bần ’ 4. Tế bào mô cứng. 5. Bó sợi. 6. Mảng mạch điểm.
Hình 8: Đặc điểm bột Hoàng Liên
Nhân xét: Qua kết quả nghiên cứu phần dược liệu và vi học thấy rằng các vị thuốc nghiên cứu phù hợp với các tài liệu thực vật đã công bố [7,9,10,11,13]. 2.3 .2 NGHIÊN cứu VỀ THÀNH PHẲN HOÁ HỌC CHÍNH.
* Định tính Aỉcaloid bằng phản ứng hoá học.
Bảng 1: Kết quả định tính Alcaloid TT
DC Dragendorff Mayer Buchardat Acid picric
HL \ị/Vàng cam \j/Trắng vàng \j/ Nâu đỏ \|/ Vàng HB vVàng cam ^Trắng vàng 'ị' Nâu đỏ \|/ Vàng THT \|/Vàng cam \|/Trắng vàng \|/ Nâu đỏ ^ Vàng
Chú thích: \ị/ ( tủa )
Nhân x é t: Qua bảng 1 thấy rằng trong dịch chiết HL, HB, THT đều có Alcaloid.
* Định tính ílavonoid bằng phản ứng hoá học.
Bảng 2 : Kết quả định tính ílavonoid. \ t t
D C \
NaOH 10% Pb acetat 30% FeCl 5% NH3 dặc Phản ứng Cyanidin
HC Màu vàng \J/ Nâu Xanh đen Vàng tăng Màu đỏ
THT Màu vàng \j/ Nâu-: Xanh đen Vàng tăng Màu đỏ
Chú thích: \|/ ( tủa )
* Định tính Alcaloid bằng SKLM.
- Hệ dung môi 1
{Toluen : Aceton : Ethylacetat; < : Acid íormic = 5:2:2:1 ]
1. Palmatin chuẩn. 2. Berberin chuẩn. 3. Dịch chiết HL. 4. Dịch chiết HB. 5. Dịch chiết THT.
Hình9: sắc ký đồ của Alcaloid trên hệ dung môi 1.
Bảng 3: Kết quả SKLM của Alcaloid trên hệ dung môi 1.
Vết
Rf X 100 và màu của các vết
Pal Ber HL HB THT
Rfy Màu Màu Rf<co Màu R£íCfi Màu RÍ-ÍÚO Màu
1 27 Vàng 27 Vàng 27 Vàng 27 Vàng 2 29 Vàng 29 Vàng 29 Vàng 29 Vàng 3 33 Vàng 33 Vàng 33 Vàng 3 35 Vàng 35 Vàng 35 Vàng 5 48 Vàng 48 Vàng 6 62 Vàng 62 Vàng 7 71 Vàng 71 Vàng 71 Vàng
Nhân xét: Ở hệ dung môi này ta thấy phương thuốc THT có 7 vết alcaloid tương tự các vết của từng vị thuốc trong phương và có Berberin
( Rf xioo = 29 ); Palmatin ( Rf X 100 = 27 ).
Hệ dung môi 2 [n-Butanol: A.acetic : H20 = 7:1:2 ]. o o o o o o o Q 0 0 0 o 0 0 ọ o 0 0 0 1. Palmatin chuẩn. 2. Berberin chuẩn. 3. Dịch chiết HL. 4. Dịch chiết HB. 5. Dich chiết THT.
Hình 10: sắc ký đồJAlcaloid trên hệ dung môi 2.
Bảng 4: Kết quả SKLM của Alcaloid trên hệ dung môi 2.
Vết
Rf X 100 và màu sắc của các vết
Pal Ber HL HB THT
Rf,« Màu Rf« Màu RỊ/íod Màu Rf/iử0 Màu R W Màu
1 39 Vàng 39 Vàng 39 Vàng 39 Vàng 2 44 Vàng 44 Vàng 44 Vàng 44 Vàng 3 48 Vàng 48 Vàng 48 Vàng 4 53 Vàng 53 Vàng 5 72 Vàng 72 Vàng 72 Vàng 6 76 Vàng 76 Vàng 76 Vang
Nhân xét: ở hệ dung môi này thấy phương THT có alcaloid tương ứng với các vết của từng vị thuốc trong phương và đều có Berberin ( Rf x ioo = 44), Palmatin( Rf xioo = 39).
Nhân xét chung: Qua 2 hệ dung môi trên, sơ bộ kết luận về thành phần hoá học của phương THT đều tồn tại các vết alcaloid tương ứng với các vết của HL, HB; đặc biệt 2 alcaloid chính là Berberin, Palmatin .
* Định tính Aavonoid bằng SKLM
- Hệ dung môi 1
[ Toluen : Chloroíorm : Aceton = 8:5:7 ]
1. Dịch chiết HC. 2. Dịch chiết THT.
Hình 11: sắc ký đồ của ílavonoid trên hệ dung môi 1. Bảng 5: Kết quả SKLM của ílavonoid trên hệ dung môi 1.
Vết Rf X 100 và màu sắc của các vết
HC THT
R f* o Màu Rf/<oo Màu
1 14 Vàng 14 Vàng 2 21 Vàng 21 Vàng 3 29 Vàng 29 Vàng 4 38 Vàng 38 Vàng 5 42 Vàng 42 Vàng 6 59 Vàng 59 Vàng
Nhân xét: ở hệ dung môi 1 thấy phương THT có 6 vết tương tự các vết của HC.
- Hệ dung môi 2
[ Chloroíorm : Acid acetic = 9:1 ]
1. Dịch chiết HC 2. Dịch chiết THT
Hình 12: sắc ký đồ Aavonoid trên hệ dung môi 2.
Bảng 6: Kết quả SKLM của ílavonoid trên hệ dung môi 2. Vết Rf X 100 và màu sắc của các vết
HC THT
Rf,oo Màu Rf^oo Màu
1 14 Vàng 14 Vàng 2 29 Vàng 29 Vàng 3 40 Vàng 40 Vàng 4 45 Vàng 45 Vàng 5 70 Vàng 70 Vàng 6 73 Vàng 73 Vàng
Nhân xét: ở hệ dung môi 2 thấy rằng phương thuốc THT có 6 vết tương tự với 6 vết của HC.
Nhân xét chung: Qua 2 hệ dung môi trên ta sơ bộ kết luận ở phương THT các vết ílavonoid vẫn tồn tại tương tự ở HC.
* Định lượng Alcaloid toàn phần
- Cân chính xác 15g dược liệu HL, HB, THT đã được xác định độ ẩm. Đem sắc như mục (2.2.1 ) ta được 15ml dịch sắc HL, 15ml dịch sắc HB, 15 ml dịch sắc THT. Đem kiềm hoá dịch sắc bằng NaOH 10% để chuyển alcaloid về dạng bazơ. Chiết alcaloid bazơ bằng chloroíorm ( 3 lần X 15ml ). Gộp dịch chiết từng loại lại, cất thu hồi dung môi. Hoà tan cắn bằng H2S 0 410%, lọc vào bình gạn, kiềm hoá dịch lọc bằng NaOH 10%, chiết lại bằng chloroíorm ( 3 lần X 15ml). Gạn lấy lớp chloroíorm, thêm Na2S 0 4 khan vào dịch chloroform. L ọ c vào cốc đã sấy khô ở trọng lượng không đổi. Bay hơi dung môi trong hốt tới khô. Sấy cắn ở 100°c đến trọng lượng không đổi. Cân cắn.
Có thể tóm tắt quá trình chiết xuất alcaloid theo sơ đồ: Dược liệu
\/ Sắc như muc ( 2.2.1)
Dịch sắc ệ--- Kiềm hoá bằng NaOH 10% \ Chiết bằng chloroíorm
Dịch chloroíorm
"hu hồi dung môi <— h2s o4 10% ^ọc
ệ--- Kiềm hoá lai bằng NaOH 10% \ r / Cắn \! I Dịch lọc \ Chiết bằng chloroíòrm Dịch chloroíorm <--- Na2S 0 4 khan
\! Loc
Dịch chloroíorm
Bốc hơi dung môi Cắn alcaloid toàn phần
Hình 13: Sơ đồ chiết xuất alcaloid.
Bảng 7: Kết quả định lượng Alcaloid của HL, HB, THT. - Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 7 và hình 14.
STT Hàm lượng alcaloid (% ) HL HB THT 1 4,18 1,72 2,00 2 4,20 1,65 2,07 3 4,10 1,62 2,11 4 4,12 1,70 2,08 5 4,15 1,72 1,99 X 4,15 1,68 2,05 s 0,04 0,05 0,05 k 4 ,1 0 -4 ,2 0 1 ,6 2 -1 ,7 4 1 ,9 9 -2 ,1 1
Nhân xét: Qua bảng ta thấy hàm lượng alcaloid trung bình của HL là 4,15%, HB là 1,68%, THT là 2,05%.
* Định lượng Aavonoid toàn phần
- Cân chính xác 15 g dược liệu HC, THT, đem sắc như mục ( 2.2.1 ) được 15ml dịch sắc mỗi loại. Nhỏ từ từ cồn 95° vào mỗi dịch sắc cho đến khi không thấy tủa xuất hiện thêm. Để lắng, lọc, cô dịch lọc trên nồi cách thuỷ đến cao mềm. Hoà tan cao mềm bằng 15ml nước sôi, lọc vào bình gạn, thêm
ethylacetat ( 3 lần X 15ml ), gạn lấy ethylacetat ở trên vào cốc đã sấy khô ở trọng lượng không đổi. Cô trên nồi cách thuỷ cho bay hết ethylacetat. Sấy cắn
ở 60-70°C đến trọng lượng không đổi. Cân.
Có thể tóm tắt quá trình chiết xuất Aavonoid theo sơ đồ:
- Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 8 và hình 16.
Bảng 8: Kết quả định lượng ílavonoid toàn phần của HC, THT.
STT Hàm lượng Aavonoid (%) HC THT 1 5,00 1,75 2 4,95 1,65 3 4,91 1,69 4 5,03 1,70 5 4,90 1,62 T 4,96 1,68 5 0,06 0,06 k 4 ,8 9 -5 ,0 3 1,61 -1 ,7 5
Nhân xét: Từ kết quả ta thấy hàm lượng Aavonoid trung bình của HC là 4,96%, của THTlà 1,68%.
* So sánh về hoá học giữa HL Sapa với HL thị trường
Trên thị trường có rất nhiều loại HL chân gà có nguồn gốc từ Trung Quốc. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sơ bộ về hoá học của một loài HL trên thị trường để so sánh vói mẫu HL Sapa. Phương pháp nghiên cứu tương tự đối với HL Sapa và đã thu được kết quả:
-V ề định tính bằng phản ứng hoá học
Đều cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung Alcaloid. - Về định tính bằng SKLM Toluen:Aceton:Ethylacetat:Formic n- Butanol:Acetic:Nước [ 5 :2 :2 :!] [7 :1 :2 ] 1. Palmatin chuẩn 2. Berberin chuẩn. 3. HL Sapa. 4. HL thị trường.
Hình 77: sắc ký đồ của HL Sapa và HL thị trường.
Nhân xét:Ta thấy HL thị trường có các vết alcaloid tương tự như các vết alcaloid của HL Sapa. Đặc biệt chúng đều chứa thành phần chính là Berberin và Palmatin.
- về định lượng: Hàm lượng alcaloid của 2 loại HL được thể hiện ở bảng 9. Bảng 9: So sánh hàm lượng alcaloid giữa HL Sapa với HL thị trường.
TT Mẫu Hàm lượng alcaloid ( % ) Nhận xét
1 HL Sapa 4,15 Hàm lượng alcaloid ở HL
Sapa cao hơn HL thị trường
2 HL thị trường 3,66
Nhân xét chung: Qua kết quả nghiên cứu trên, ta thấy rằng HL Sapa và HL thị trường đều có các thành phần alcaloid tương tự nhau, đặc biệt đều có: ; thành phần chính Berberin và Palmatin. về hàm lượng alcaloid đều có tỷ lệ tương đối cao ( trong đó HL Sapa cho hàm lượng cao hơn 0,49%). Điều này rất có ý nghĩa về mặt sử dụng.
2 .3 .3 NGHIÊN cứ u TÍNH KHÁNG KHUẨN
Kết quả được thể hiện ở bảng 10 và hình 18,19.
Bảng 10:
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của THT và từng vị thuốc trong phương. STT \ K QVK Pen Đường kính vòng vô khuẩn ( mm ).Gen HL HB HC THT
1 BP 17,26 14,40 8,00 7,50 14,74 2 BC 21,70 17,00 16,20 17,12 20,81 3 SL 18,80 18,34 13,50 11,00 14,38 4 BS 18,86 12,90 10,00 11,50 18,14 5 Sta 15,80 15,00 12,15 12,30 18,60 6 Pro 24,55 16,25 13,20 11,13 18,32 7 Pseu 16,58 8,34 0,00 8,00 13,20 8 Typh 15,50 13,20 9,15 12,15 19,46 9 Shi 19,21 13,12 7,00 7,00 17,35 10 EC 23,84 16,40 10,12 12,51 16,93
Nhân xét: - HL, HB, HC đều có tác dụng kháng khuẩn; HL tác dụng trên 10 chủng vi khuẩn thử; HB tác dụng trên 9 chủng vi khuẩn (trừ Pseu); HC tác dụng trên 10 chủng. Trong đó vòng vô khuẩn của HL lớn nhất.
- THT tác dụng cả trên 10 chủng trong đó có 9 chủng tác dụng tốt hơn các thành phần. Đặc biệt trên các chủng Sta, Typh THT có tác dụng mạnh hơn kháng sinh chuẩn.
Đ ườ ng kí nh vò ng vô kh uẩ n 5 . Đ ư ở n g k ín h v ò n g vô kh u ẩ n BP BC SL BS sta
ình 18: Biểu đồ biểu diễn vòng vô khuẩn của Pen, HL, HB, HC, THT
□ Pen 0HL SHB BHC 0THT Mau thử □ Gen 0HL HHB HHC 0THT Mẫu thử
Hình 19: Biểu đồ biểu diễn vòng vô khuẩn của Gen, HL, HB, HC, THT 36
Hình 20: vô_ khuẩn của kháng sinh và các mẫu thử trên vi
khuẩn Gram (-) Proteus mirabilis S k i Shigella ỷlexneri Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Salmonella ty phi'
Hình 21: \é>no v<5 khuẩn của kháng sinh và các chế phẩm thử trên vi khuẩn Gram ( + )
Bacillus cereus
Sarcina lutea Bacillus pumỉỉus
Bacỉllus subtilỉs Staphylococcus aureus
2.4 BÀN LUẬN
- Về dược liệu HL
Có rất nhiều loài HL chân gà. Ở Việt Nam có 2 loài Coptis chinensis Franch. và Coptis teeta Wall.. Hiện nay ở nước ta HL chưa được trồng trên qui mô lớn, nguồn nguyên liệu còn hạn chế. Mặt khác HL trên thị trường chủ yếu lại là HL Trung Quốc.
Qua nghiên cứu, so sánh HL Sapa và HL thị trường thấy rằng chúng đều chứa các thành phần alcaloid tương tự nhau và đặc biệt là Berberin và Palmatin. Điều này rất có ý nghĩa về mặt sử dụng và có thể dùng HL Trung Quốc để thay thế cho HL Sapa và ngược lại.
- Về tác dụng kháng khuẩn
HL, HB, HC đều có tác dụng kháng khuẩn tốt trên các vi khuẩn thử, đặc biệt tác dụng tốt khi phối hợp thành phương THT. Điều đó chứng tỏ phương THT là một phương thuốc có ý nghĩa trong điều trị. Hiện nay, phương thuốc THT được dùng chữa nhiều bệnh khác nhau như: Viêm gan, viêm thận...
-V ề dạng bào chế
Qua nghiên cứu thấy rằng: khi phối hợp 3 vị thuốc thành phương THT đồng thời sử dụng phương pháp sắc để lấy dịch thuốc vẫn tồn tại các thành phần alcaloid và ílavonoid trong dịch sắc THT. Điều đó gợi mở cho chúng ta thấy rằng dùng phương pháp sắc ( phương pháp mà YH C T vẫn làm ) có sức thuyết phục lớn.
PHẦN3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT
3.1 KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau: * Về dược liệu:
Đã mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm bột của từng vị thuốc trong THT, thấy chúng phù hợp với các đặc điểm trong dược điển Việt Nam, các tài liệu thực vật khác đã công bố.
* Về hoá học:
-V ề định tính thấy trong nước sắc THT vẫn tồn tại cả hai nhóm Flavonoid và Alcaloid. Về SKLM thấy rằng THT có đầy đủ các vết alcaloid và Aavonoiđ của HL, HB, HC. về hàm lượng HL chứa 4,15% alcaloid, HB chứa 1,68% acaloid, HC chứa 4,96% tlavonoid, THT chứa 2,05% alcaloid và 1,68% Aavonoid.
- Đã tiến hành so sánh hai loài HL chân gà là HL Sapa và HL thị trường thấy rằng chúng có thành phần alcaloid tương tự nhau. Do đó có thể thay thế khi cần thiết.
* Về tác dụng kháng khuẩn:
Đã chứng minh được tác dụng kháng khuẩn của HL, HB, HC trên các vi khuẩn kiểm định. Đồng thời chứng minh được tác dụng kháng khuẩn hiệp đồng của 3 vị thuốc khi phối hợp trong phương THT.
3.2 ĐỂ XUẤT.
THT là phương thuốc kinh điển của Đông y, chữa được nhiều bệnh nan giải. Cần tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn về mặt hoá học, tác dụng sinh học và dạng bào chế để hiện đại hoá một phương thuốc có hiệu quả điều trị tốt của