3.1.6. Môi trƣờng nghiên cứu
Bảng 3.1. Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu
STT Tên môi trƣờng Thành phần Mục đích sử dụng
1 Wakimoto Khoai tây 300 g NaHPO4.12H2O 2 g Ca(NO3)2.4H2O 0.5 g Peptone 5 g Saccarose 15 g Agar 15 g Nước chưng cất 1000ml pH 7.0
Nuôi cấy và bảo quản 10 chủng Xoo
2 Tinh bột tan lên men
Tinh bột tan 10g Cao nấm men 2 g Agar 15 g Nước chưng cất 1000 ml pH 7.3 Nuôi cấy các chủng xạ khuẩn actinomycete
3 Mạch nha lên men
Men mạch nha 3 g Cao nấm men 3 g Glucose 10g Peptone 5 g Agar 17 g Nước cất 1000 ml pH 7.0
Nuôi cấy nấm Candida
albicans
4 Muller Hinton agar (MHA)
BD Nuôi cấy vi khuẩn
Micrococcus luteus và Escherichia coli 5 Ashby Glucose 20 g K2HPO4 0.2 g MgSO4.7H2O 0.2 g CaCO3 5 g
Nuôi cấy vi khuẩn
FeCl3.6H2O 0.1 g Na2MoO4 0.05 g Thạch 15 g H2O 1000 ml 6 Nutrient Agar Cao thịt 3 g Peptone 5 g Thạch 15 g H2O 1000 ml
Nuôi cấy vi khuẩn
Pseudomonas puttida
3.1.7.Dụng cụ, thiết bị và máy móc
Máy lắc ổn nhiệt CERTOMAT® BS1 (Đức), GYROMAXTM 737 (Đức); máy li tâm A15, CP30, máy cô mẫu chân không, tủ cấy Nuare, bể điện di ADN, máy PCR, lò vi sóng…
Một số hoá chất và dụng cụ thí nghiệm khác do Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh và Công nghệ sinh học, Đại Học Quốc Gia Hà Nội cung cấp.
Khoá luận được tiến hành tại Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh và Công nghệ sinh học, Đại học Công Nghệ – ĐHQGHN.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Định loại chủng xạ khuẩn
3.2.1.1. Định loại bằng đặc điểm sinh học
Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch YS (Hop & Ando, 2010) có thành phần như sau:
Cao nấm men 2g
Tinh bột tan 10g
Thạch 17g
H2O 1000 ml
Môi trường này được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút và đổ ra đĩa petri, dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng xạ khuẩn ria một đường zikzak trên mặt thạch.
Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc. Các đặc điểm hiển vi như từng phần của hệ sợi cơ chất, hình thái của hệ sợi khí sinh, cấu trúc của các chuỗi bào tử và các dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi liên kết với một máy ảnh và một phần mềm lưu trữ ảnh.
Chủng xạ khuẩn được cấy trên đĩa petri chứa môi trường YS, gài lamel vào thạch chếch 45º. Sau đó nuôi 4 – 5 ngày ở 30ºC rồi đem soi các lamel có xạ khuẩn dưới kính hiển vi (Sakiyama et al, 2009).
3.2.1.2. Định loại bằng các đặc tính hóa sinh
Đầu tiên, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP9 dịch thể (150 vòng/phút ở 20oC) khoảng 2 ngày để xạ khuẩn phát triển. Thành phần môi trường ISP9 dịch thể gồm có: (NH4)2SO4 2.64 g KH2PO4 2.38 g K2HPO4. 3H2O 5.65 g MgSO4. 7H2O 1 g H2O 1000 ml
Tiếp theo, nó sẽ được cấy vạch sang các môi trường đường khác nhau và nuôi trong tủ ấm (30oC) 7 ngày. Các môi trường này có thành phần cơ bản là môi trường ISP9 và được bổ sung thêm các nguồn đường khác nhau với nồng độ 1% (m/v) (Jiang Bian et al, 2009). Các nguồn đường được sử dụng lần lượt là: D-glucose (đối chứng +), D-xylose, D-fructose, D-mannitol, L-arabinose, cellobiose, saccharose, rhamnose, inositol, rafinose. Khả năng đồng hóa đường được đánh giá bởi khả năng sống và phát triển trên các môi trường đường này so sánh với môi trường đối chứng – (ISP9 không bổ sung đường) và môi trường đối chứng + (Shirling & Gottlieb, 1966).
Để kiểm tra khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối của xạ khuẩn, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP4 dịch thể có thành phần cho một l nước gồm:
Tinh bột 10 g/l Pepton 5 g/l (NH4)2SO4 2 g/l CaCO3 1 g/l K2HPO4. 3H2O 1 g/l MgSO4 1 g/l NaCl 1 g/l
Phương pháp thử tương tự như trên nhưng thí nghiệm kiểm tra khả năng đồng hóa Melanin sử dụng môi trường thạch ISP6 và kết quả thử Melanin được đánh giá dựa trên vòng phân giải melanin màu đen xung quanh khuẩn lạc còn thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu muối sử dụng môi trường YS bổ sung thêm NaCl có nồng độ lần lượt từ 1%-5% (Shirling & Gottlieb, 1966).
Thành phần môi trường ISP6:
Bacter pepton 15 g Protease pepton 5 g K2HPO4 1 g Fe(NH4)3(C6H5O7)2 0.5 g Na2S2O3. 5H2O 0.08 g Agar 15 g H2O 1000 ml
3.2.1.3. Phương pháp phân loại dựa trên trình tự 16S - rRNA
Tách DNA từ xạ khuẩn
DNA tổng số của xạ khuẩn được tách theo phương pháp mô tả bởi Sakiyama và cộng sự (2009) .
- Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở nhiệt độ 30ºC.
- Sau đó ly tâm dịch xạ khuẩn với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút để thu tế bào.
- Các tế bào được làm đồng nhất bởi các que nhựa vô trùng, sau đó hoà sinh khối tế bào trong 100µl TE 1X trong 2 – 3 phút.
- Tế bào được phá vỡ nhờ xử lý với 0.4 mg lysozyme trộn đều, ủ ở 37ºC trong 1 giờ, trộn đều 3 phút.
- Bổ sung vào 100 µl SDS 10%, trộn đều 2 – 3 phút, ủ ở 37ºC trong 30 phút.
- Sự chiết xuất được tiến hành bằng cách thêm vào cùng một thể tích phenol:choloroform: isoamine alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn đều và ly tâm với tốc độ 15000 rpm trong 5 phút ở 4ºC. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.
- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml ethanol 100%, trộn đều rồi đặt trong đá 30 phút.
- Ly tâm 15.000 rpm trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.
- Phần tủa được rửa bằng ethanol 70%.
- Sau đó làm khô DNA bằng máy cô quay chân không.
- Hoà tan DNA trong 50 – 100 l nước hoặc TE.
- Kiểm tra các sản phẩm bằng điện di
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1 g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X Loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
Mồi (trình tự) Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.
Mồi ngược1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
Thành phần
10X buffer 10 l
dNTP 2.0 mM 10 Mồi xuôi (10 pmol/l) 2 l
Mồi ngược (10 pmol/l) 2 l
Taq polymerase (5u/l) 2 l
DNA khuôn (50-100g/l) 1 – 2 l
H2O đủ 100 l
Điều kiện phản ứng
Biến tính: 950C - 3 phút
Tiếp đến 30 chu kỳ: 950C – 30giây, 560C – 15 giây, 720C – 1 phút
Tổng hợp cuối cùng: 720C – 5 phút
40C –
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 l dung dịch 6X Loading buffer với 5 l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5
l/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát trên máy soi gel.
Tinh sạch sản phẩm PCR
Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 rồi trộn đều.
Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút.
Đổ bỏ dịch phía dưới cột.
Bổ sung 750 l PE buffer lên cột và ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút
Đổ bỏ dịch dưới cột.
Ly tâm tiếp 10.000 rpm trong 1 phút.
Chuyển cột sang ống eppendoft mới.
Thêm 30l nước. Sau đó để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút rồi lấy dịch phía dưới.
Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7.
Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự
Mồi (trình tự) 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. Thành phần
Termix: 8l (9 µl Buffer 5X, 18 µl Bigdye Ready Reaction premix, 9 µl H2O)
Mồi: 1l
DNA khuôn: 1l ( nồng độ DNA là 40– 60 g/ml)
Điều kiện phản ứng
Biến tính: 960
C – 1 phút
Tiếp đến 25 chu kỳ: 960C – 10giây, 500C – 5 giây
Tổng hợp cuối cùng: 600C – 4 phút
Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
Chuyển 20l sản phẩm sang ống eppendoft sạch.
Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm 15.000 rpm trong 15phút.
Bỏ phần dịch nổi ở trên rồi thêm vào 60l ethanol 70% để rửa.
Ly tâm 15.000 rpm, 10 phút và làm khô.
Thêm 10l HiDi Formamide.
Để ở 960C trong 2 phút.
Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh.
Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.
Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa ribosome 16S của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tra cứu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mức độ tương đồng cao nhất về trình tự đoạn 16S-rRNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng chuẩn đã công bố sử dụng công cụ tra cứu Eztaxon phiên bản 2.1.
Sau khi đã xác định được tên chi của các chủng nghiên cứu, trình tự đoạn 16S- rRNA các chủng chuẩn của các loài trong chi được tải về từ ngân hàng gen. Kết hợp với trình tự của chủng được phát hiện trong nghiên cứu này, các đoạn tương đồng trong trình tự nucleotide của đoạn 16S-rRNA được sắp xếp sử dụng công cụ ClustalW trong phần mềm Mega 5.1. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining sử dụng phép toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1.000 lần. Các trình tự
tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank… [Kim et al, 1999].
3.2.2. Chọn lọc môi trƣờng nuôi cấy phù hợp nhất cho khả năng sinh kháng sinh của VN08A12
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 7 môi trường sinh kháng sinh để tìm hiểu xem: môi trường nào phù hợp và tạo ra được nhiều chất kháng sinh từ VN08A12 .
Bảng 3.2. Danh sách về thành phần các môi trƣờng dùng cho VN08A12
STT Môi trƣờng Thành phần
1 Môi trƣờng 2M Tinh bột tan 20 g Khô đậu tương 15 g Cao nấm men 2 g
CaCO3 4 g
Nước cất 1000 ml pH 6.2
2 Môi trƣờng 301 Tinh bột tan 24 g Glucose 1 g Peptone 3 g Cao thịt 3 g Cao nấm men 5 g CaCO3 4 g Nước cất 1000 ml pH 7.0
3 Môi trƣờng A-16 Glucose 20 g Pharmamedia 10 g CaCO3 5 g Nước cất 1000 ml pH Không điều chỉnh 4 Môi trƣờng No 8 Casitone 7.5 g Cao nấm men 7.5 g Glycerol 15 g NaCl 2.5 g Nước cất 1000 ml pH Không điều chỉnh
5 Môi trƣờng A-3M Glucose 5 g Glycerol 20 g Tinh bột tan 20 g Pharmamedia 15 g
Cao nấm men 3 g Diaion HP-20 10 g Nước cất 1000 ml pH 7.0
6 Antibiotic-producing
medium (APM): Môi trƣờng sinh kháng sinh
Tinh bột tan 10 g Glucose 10 g Khô đậu tương 10 g CaCO3 3 g Peptone 10 g Tween 80 1 giọt Nước cất 1000 ml pH 7.0
7 Modified APM (MAPM): Môi trƣờng sinh kháng sinh cải tiến Tinh bột tan 10 g Glucose 10 g Bã đậu tươi 10 g CaCO3 3 g Peptone 10 g Tween 80 một giọt Nước cất 1000 ml pH 7.0
Môi trường trên được cung cấp bởi TS. Hiroshi Kinoshita, trung tâm quốc tế về công nghệ sinh học, Trường đại học Osaka cung cấp.
Phương pháp thử hoạt tính sinh kháng sinh của VN08A12 trên môi trường đĩa thạch như sau:
Phương pháp nuôi cấy xạ khuẩn
VN08A12 được cấy chuyển sang môi trường thạch YS (Hop & Ando, 2010) có thành phần như sau: Cao nấm men 2 g Tinh bột tan 10 g Thạch 17 g H2O 1000 ml pH 7.3
Môi trường này được hấp khử trùng ở 121o
C trong 15 phút và đổ ra đĩa petri, dùng que cấy đã khử trùng lấy một vòng xạ khuẩn ria một đường zikzak trên mặt thạch.
Sau đó, VN08A12 được cấy chuyển vào từng môi trường lỏng có thành phần như đã kể trong bảng 3.2. Chủng xạ khuẩn này được nuôi cấy lắc, sau 7 ngày, dịch nuôi cấy được dùng để thử hoạt tính kháng 10 nòi Xoo. Đường kính kháng các nòi Xoo được đo và thí nghiệm lặp lại 3 lần để có quyết định xem môi trường nào là tốt nhất cho VN08-A12 lên men sinh kháng sinh.
Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Xoo
Vi khuẩn Xoo được nuôi cấy trong môi trường Wakimoto (1958). Thành phần môi trường bao gồm:
Khoai tây 300 g Sucrose 15 g Pepton 5 g Na2HPO4.12H2O 2 g Ca(NO3)2 0.5 g Agar 15 g H2O 1000 ml pH 7.0
Môi trường Wakimoto được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút rồi được đổ ra các đĩa petri. Vi khuẩn Xoo được bảo quản trong môi trường Skim-milk glutamate natri (Furuya et al, 2002) có thành phần môi trường: sữa tách bơ: 1.5g; mì chính: 0.25g; nước cất: 100ml. Trước khi tiến hành thử hoạt tính đối kháng, nguồn vi khuẩn được cấy chuyển từ môi trường bảo quản sang môi trường Wakimoto thạch nghiêng, nuôi ở 28oC; sau 48h, lấy ba vòng que cấy vi khuẩn Xoo và chang đều trên mặt đĩa thạch.
Thử hoạt tính đối kháng Xoo bằng phương pháp nhỏ dịch nuôi cấy
Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Xoo của các chủng xạ khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp nhỏ dịch nuôi cấy (Chythanya et al. 2002) như sau:
Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường dịch lỏng đã kể trên trong 7 ngày
Bước 2: Chang đều vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch Wakimoto
Bước 4: Đồng nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn: nhỏ 100 μl sang đĩa thạch đã đục lỗ ở bước 2 rồi chuyển vào tủ định ổn 30oC.
Bước 5: Quan sát kết quả sau 1-2 ngày. Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xoo được đánh giá bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) trên đĩa thạch đồng nuôi cấy 2 vi sinh vật trên.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần để chọn được môi trường sinh kháng sinh tốt nhất phù hợp cho VN08A12 .
3.2.3. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch lên men xạ khuẩn lên cây đậu xanh
Chúng tôi sử dụng giống đỗ xanh KT 11, là giống hiện đ ang được trồng phổ biến ở Viê ̣t Nam , được chọn để thực hiện thí nghiệm để đánh giá ảnh hưởng của dịch lên men xạ khuẩn lên cây đỗ xanh.
Các cây đỗ xanh được trồng trong 8 hộp xốp và nuôi cấy ở ngoài môi trường tự nhiên. Mỗi hộp được đánh dấu là 1 lô (theo thứ tự từ 1 đến 8), trong đó từ lô 1 đến lô 5 dùng làm lô thí nghiệm (được phun sản phẩm lên men của xạ khuẩn), còn từ lô 6 đến lô 8 làm lô đối chứng (được phun bằng nước cất đã khử trùng). Trong đó, mỗi lô đều trồng 20 cây đỗ xanh với tỉ lệ khoảng cách mỗi cây là 5 cm.
Chủng xạ khuẩn đã được chọn lọc tại phòng thí nghiệm và được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong môi trường sinh kháng sinh (MAPM) trong ba ngày. Khi sử dụng sản phẩm lên men của xạ khuẩn, chúng tôi pha với sản phẩm lên men của xạ khuẩn với nước cất (đã được khử trùng) với tỉ lệ 3:1. Sau đó, phun 1000 ml dung dịch lên men của xạ khuẩn với từng lô thí nghiệm (1000ml/1lô).
Sau khi phun sản phẩm lên men (lô thí nghiệm) và nước (lô đối chứng) cho từng lô cây, chúng tôi tiến hành đo chiều cao cây theo từng ngày để kiểm tra và đánh giá ảnh hưởng của sản phẩm lên men xạ khuẩn lên cây đỗ xanh.
3.2.4. Phƣơng pháp thử nghiệm ảnh hƣởng của dịch lên men xạ khuẩn lên chuột nuôi thí nghiệm
Chuột thí nghiệm được nuôi tại phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ thực