khối nấm Gal
Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD, NOX chúng tôi đã chọn enzym NOX để tách, tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất
Để tinh sạch NOX từ sinh khối của nấm GaU chúng tôi tiến hành thu dịch chiết bổ sung thêm 0,1 thể tích đệm Tris -H Q lOOmM, pH 8,0, đé nồng độ cuối cùng của đệm là lOOmM, pH đảm bảo đạt 8,0 và cho sắc ký qua cột gel DE-52, cột Sigma có kích thước 3x14cm, được cân bằng với cùng đệm trên. Phần prôtein gắn trên cột được rửa chiết bằng gradient NaCl từ 50mM - lOOOmM pha trong đệm Tris- H a lOOmM, pH 8,0.
Kết quả phân tích protein và hoạt độ NOX cùa các phân đoạn sắc ký qua cột thấy phẩn dịch không hấp thụ không có hoạt độ NOX. Phần hấp thụ được đẩy ra dưới dạng 3 đỉnh protein chính, ttong đó chỉ có đỉnh đầu tiên được đẩy ra ở nồng độ muối khoảng 370mM là có hoạt độ NOX. Sử dụng diện di SDS-PAGE để đánh giá độ sạch của chế phẩm NOX sau khi qua cột DE-52 (hình 9) cho thấy chế phẩm có một băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa và một số băng protein khác nhưng ít rô nét hơn (Hình 9. cột 2).
Để tiếp tục tinh sạch NOX từ n â n Gal, chúng tôi tiến hành tập trung các phân đoạn có hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô đặc mẫu bằng centricon và cho sắc ký qua cột lọc gel Sephadex G-100. Cột có kích thuớc lx70cm, được cân bằng với đệm. Kết quả rủa chiết và phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 cho thấy có 2 đỉnh protein chính, ữong đó đỉnh thứ nhất có hoạt độ NOX.
Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bước lọc gel cho thấy ngoài băng protein 40 kDa vẫn còn một số băng khác có mặt trong chê phẩm, cho thấy chế phẩm chưa được tinh sạch hoàn toàn và cần tiếp tục tinh sạch.
M 2 3 kDa 97 66 45 30 20,1 14,4
Hình 9 : Kết quả điện di phổ bãng protein cùa nấm Gal
Cột M: Thang chuẩn protein
Cột 1: Dịch mẫu thô nám Gal; cột 2 : Mẫu nám Gal chạy qua cột DE-52 Côt 3: Mẫu nấm Gal chạy qua cột l ọ c g e l G -100
5. Nghiên cứu một số tính chất enzym NOX của nấm Gal
Sau khi thu được chế phẩm NOX tinh sạch một phần qua bước sác ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel, chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu một số tính chất của enzyme.
5.1 Độ bền nhiệt
Kết quả phân tích độ bền của enzym NOX bằng cách ủ enzym ở các nhiệt độ khác nhau và sau đó xác định hoạt độ còn lại (hình 10) cho thấy enzym NOX của nấm Gaỉ là loại tương đối bền nhiệt, ở nhiột độ 30-60 °c sau 15 phứt xử lý enzym vẫn
giữ hoạt độ gần như ban đầu. Tuy vậy, khi xử lý ở 80°c, ưong 15 phút thì enzym chỉ còn 10% hoạt độ 0.6- 0.5 B n m ■ Hoạt độ (mU/m gPr) 0.4 m U /m g P r 0.3- 0.2- 0.1- 0 0-1 30 1 60 1 80 N hiệt độ
Hình 10: Độ bền với nhiệt của enzym NOX
5.2. Ảnh hưởng của một sô ion kim loại
Kết quả phân tích ảnh hưởng của 5 ion kim loại (Ca2+, Cu2+, Fe3+, Mg2+, Zn2+) và anion F lên hoạt độ của NOX (hình 11) cho thấy chỉ có Fe3+ ở nồng độ 3-4 mM có khả năng làm tăng một phần hoạt độ của NOX. Các ion Ca2+, Mg2+ và Zn2+ và anion F không ảnh hưởng đến hoạt độ enzym. Còn ion Cu2+ ở nồng độ 4 mM ức chế hoạt độ của NOX.
0 1 2 3 4 5 6
Nồng độ (n M )
Hình 11: Anh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ của NOX
5.3. Xác định NOXcủa nấm Gal là thuộc loại sinh H20 hay sinh H20 2
Theo các nghiên cứu khác nhau, NADH oxidase của các sinh vật được phân thành hai nhóm : nhóm thứ nhất xúc tác cho phàn ứng oxi hoá một phân tử NADH đến oxi và hình thành một phân tử H20 2, vì vậy được gọi là NOX sinh H20 2. Nhóm thứ hai oxi hoá 2 phân tử NADH và tạo H2Or nên có tên là NOX sinh H20 . Kết quả xác định lượng H20 2 sau phản ứng giũa NADH và enzym cho thấy H20 2 không hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase của nấm Gal thuộc nhóm sinh H20 .
Bước đầu tìm hiểu các enzym bảo vệ oxi hoá của Nấm Linh Chi, chúng tôi đã tập trung vào ba enzym chính, đó là superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), NADH oxidase (NOX). Đây là các enzym bảo vệ tổn thương oxi hoá có mặt ở hầu hết các cơ thể các sinh vật sống trong tự nhiên. Các enzym này đã được nghiên cứu khá kỹ nhưng đối vói Nấm Linh Chi Ganoderma lucidium cho đến nay vẫn còn rất ít những công bố về kết quả nghiên cứu các enzym này.
Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi về quá trình sinh trưởng và phát triển nấm Gal cho thấy ở điều kiện nuôi cấy sinh khối hệ sợi của nấm Gal, phát triển thích hợp ở điều kiện 26 - 28°c. Tốc độ mọc của sợi từ 150 - 200 ml/ giờ ở giai đoạn phát triển tối thích. Trong điều kiện nuôi cấy cho ra quả thể cũng cho thấy hệ sợi phát triển tốt trong biên độ nhiệt dao động từ 26 - 30°c. Sau khoảng 2 - 3 tháng nấm phát triển thành thục và cho năng suất tương đối thấp. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với các kết quả đã công bố bởi các tác giả Trịnh Tam Kiệt, Lê Xuân Thám.
Kết quả điều tra của chúng tôi về sự có mặt của ba enzym này ở nấm Gal cho thấy cả ba enzym bảo vệ oxi hoá là SOD, CAT và NOX của nấm Gal, đều thấy cả ba enzym đều có mặt ở nấm Gal cả ở dạng sinh khối và quả thể. Tuy nhiên, có sự khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu này, cụ thể là đối với enzym superoxide dismustase (SOD), dạng sinh khối và quả thể đều thấy có mặt của enzym này, ở dạng quả thể hoạt độ của enzym này xuất hiện ở mức hoạt độ rất thấp - 1,517 đv/mg Pr, còn ở dạng sinh khối là 10,279 đv/ mg Pr.
Đối với enzym CAT, chúng tôi cũng điều tra ừên cả hai mẫu quả thể và sinh khối của nấm Gaỉ. Kết quả cho thấy enzym này có mặt ở cả hai loại mẫu. Bước đầu phân tích hoạt độ của enzym cho thấy enzym CAT ở dạng quả thể cao hơn chút ít so với mẫu ở dang sinh khối. Mức so sánh này được thể hiện ở hình 7.
Về enzym NOX, khi xác định hoạt độ của enzym này, bước đầu chúng tồi nhận xét hoạt độ enzym NOX cuả nấm Gaỉ nhìn chung là tương đối thấp, chỉ đạt ở khoảng 0.049 đv/g nguyên liệu tươi. Nhìn vào biểu đồ xác định hoạt độ enzym NOX
ở hình 3 cho thấy hoạt độ enzym NOX của nấm Gal ở dạng sinh khối cao hơn so với dạng quả thể.
THẢO LUẬN
Tiếp theo những kết quả bước đầu thu được sau khi xác định hoạt độ của ba enzym bảo vệ oxi hoá của nấm Gứ/, là SOD, CAT và NADH oxidase, chúng tôi đã chọn enzym NOX làm đối tượng nghiên cứu sâu thêm. Sau khi chiết lượng protein dạng dịch thô từ sinh khối sợi nấm Gal, chúng tôi bước đầu tinh sạch enzym này từng phần bằng phương pháp sắc ký qua cột gel trao đổi ion DE -52. Các quá trình cho mẫu chạy qua cột trao đổi ion, các chế phẩm được thu qua các phân đoạn khi đẩy ra khỏi cột kết quả ở những phân đoạn thu được bao gồm có ba đỉnh protein chính, chỉ có đỉnh đầu tiên khi đẩy mẫu ra với nồng độ muối của đệm đẩy 370 mM xuất hiện hoạt độ của enzym NOX. Kết quả sử dụng cột gel trao đổi ion DE -52 cho thấy đã loại được hơn 90% protein không mong muốn từ dịch chiết thô ban đầu, đây là một bước rất hiệu quả để bước đầu tinh sạch enzym NOX từ nấm Gal, các phân đoạn có hoạt tính enzym NOX được tập trung lại và tiếp tục cho qua cột lọc gel Sephadex G- 100. Kết quả thu được ở hình 9, kiểm tra hoạt độ riêng của NOX sau khi qua cột gel này đã được tăng lên đáng kể. Khi phân tích phổ băng enzym NOX bằng kĩ thuật điện di sử dụng SDS - PAGE để đánh giá độ sạch cùa chế phẩm cho thấy mẫu nấm Gal có một băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa. Theo chúng tôi bàng 40 kDa này rất có thể NOX. Tuy vậy, chế phẩm thu được vẫn còn một số băng protein khác và cần được tiếp tục tinh sạch.
Để đi sâu tìm hiểu kỹ thêm về enzym NOX của nấm Linh Chi, chúng tôi đã nghiên cứu thêm về một sô' tính chất của enzym này. Với kết quả phân tích độ bền nhiệt của enzym NOX đã xác định được enzym này có tính tương đối bền nhiệt, ở
80°c khi xử lý mẫu trong 15 phút thì enzym chỉ còn lại 10% hoạt độ ban đầu.
Nghiên cứu tính chất ảnh hưởng của một số ion kim loại cho thấy như biểu đồ ở hình 11 chỉ có Fe3+ ở nồng độ 3-4 mM có khả năng làm tăng hoạt độ của enzym NOX còn các ion khác và anion F " không ảnh hưởng mấy đến hoạt độ của enzym. Với ion Cu2+ ờ 4 mM cho thấy có khả năng ức chế hoạt độ của enzym này.
Các nghiên cứu về enzym NOX đã xác định được enzym NOX là một nhóm enzym xúc tác cho phản ứng oxi hoá khử với sự tham gia của oxi phân tử và cơ chất NADH. Enzym này rất phổ biến ở nhiều loài sinh vật. Enzym NOX thường gắn trên mặt màng tế bào. Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy enzym này được phân ra chủ yếu thuộc hai nhóm. Một nhóm enzym NOX xúc tác phản ứng oxi hoá một phân tư NADH để tạo thành H20 2 và nhóm thứ hai xúc tác cho phản ứng oxi hoá 2 phân từ
Linh Chi thuộc nhóm nào, chúng tôi đã xác định lượng H20 2 sau phản ứng giữa NADH và enzym. Kết quả cho thấy lượng H20 2 không được hình thành sau phản ứng, chứng tỏ rằng NADH oxidase của nấm Linh Chi thuộc nhóm sinh nước.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
Điều tra hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá ỉà enzym SOD, CAT và NOX ở dạng mẫu quả thổ và sinh khối thấy có sự khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu
Bước đầu thu chế phẩm tinh sạch enzym NOX bằng phương pháp sắc ký qua cột gel trao đổi ion DE-52 và cột lọc gel Sephadex G-100 cho thấy chế phẩm có một băng protein khoảng 40 kDa. Ngoài ra vẫn còn có một số băng protein khác nữa.
Xác định tính chất của enzym NOX của nấm Gal cho thấy enzym này thuộc nhóm sinh nước, khá bền nhiệt và được hoạt hoá bởi Fe3+ và ức chế bởi Cu2+.
2. Kiến nghị
Đối tượng nghiên cứu là loại nám có tính dược liệu cao, gần đây được nâng lên hàng biệt dược. Yêu cầu được điều tra sâu hơn nữa ở dạng quả thể, phần tinh sạch enzym cần làm thêm các loại cột khác nữa để thu được chế phẩm có độ tinh sạch hơn nữa. Cần có thêm các kết quả so sánh giũa loại nấm Linh Chi nuôi trồng với các loại cổ Linh Chi.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt.
1 Chuyên san Nấm Linh Chi Ganodermataceae Denk - Bộ Y tế xuất bản 1995. 2 Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý ở Việt Nam, Nhà xuất bản mũi
Cà Mau -1996
3 Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa - Thực tập Hoá sinh học - Nhà xuất bản Đại Hoc Quốc Gia - 2004
4 Trịnh Tam Kiệt - Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật - Hà N ộ i , 1981
Tài liệu tiếng Anh
5 Abe, Y., Okazaki, T., (1987), “Purification and properties of the manganese superoxid dismutase from the liver of bullfrog Ranacatesbeiana”, Arch. Biochemophys., 1, pp. 241-248.
6 Aebi, H. E., (1987), "Catalase" In: Methods of enzymatic Analyis, 3, eds. Bermeyer, J., Grabl, M., VCH Publishers. NewYork., pp. 273-285.
7 Amstad, p., Cerutti, p., (1990), "Genetic Modulation of the cellular antioxidants defense capacity", Eviron. Health. Perspect., 88, pp. 77-82.
8 Barrière, G , Bruckner, R., Talon, R., (2001), “Characterization of the Single Superoxide dismutase of Staphylococcus xylosus”, Appl. Environ. Microbiol., 67, pp. 4096-4104.
9 Benov, L., Sage, H., Fridovich, I., (1997), “The copper-and zinc-containing superoxide dismutase from Escherichia coir, Molecular weight and stability, 340, pp. 305-310.
10 Canvin, J., Langford, p. R., Wilks, K. E., Kroll, J. s, (1996), “Identification of sodC encoding periplasmic [Cu,Zn]- superoxide dismutase in Salmonella”, Fems. Microbiol., 136, pp. 93-98.
11 Chueh, P. I , (2000), “Cell membrane redox systems and transformation”, Antioxid. Redox. Signal., 2(2), pp. 177-187.
12 Cocco, D., Rinaldi, A., Savini, I., Cooper, J. M., Bannister, J. V., (1988),
"NADH oxidase from the extreme thermophile Thermus aquatic us YT-1. Purification and characterisation", Eur. J. Biochem., 174, pp. 267-271.
13 David Toomey and Stephen, G. M., (1998), "Purification and characterisation of NADH oxidase from Thermus aquaticus YT-1 and evidence that is function in a peroxide reduction system", Eur. J. Biochem., 251, pp. 935-945.
14 Faư, s. B-, Kogoma, T., (1991), “Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium”, Microbiol. Review. (USA)., 55(4), pp. 561-585.
15 Forest, K. T., Langforf, p. R., Kroll, J. s., Getzoff, E. D., (2000), “Cu, Zn Superoxide dismutase structure from a microbial pathogen establishes a class with a conserved dimer interface”, J. Mol. Biol., 296, pp. 145-153
16 Fridovich, I., (1989), " Supeoxide dismutase", J. Biol. Chem., 264, pp 7761- 7764.
17 Higuchi, M., Shimada, M., Matsumoto, J., Yamamoto, Y., Rhaman, A., Kamio, Y., (1994), "Molecular cloning and sequence analysis of the gen encoding the H20 2-forming NADH oxidase from Streptococcus mutans", J. Gen. Microbiol., 139, pp. 2343-2352.
18 Kono, Y., Fridovich, I., (1983), “Isolation and of characterization the pseudocatalase of Lactobacillus plantarwrì\ J. Biol. Chem., 258, pp. 6015- 6019.
19 Leammli, V. K., (1970), “Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4”, Nature., 227, pp. 680-685.
20 Lowry o . H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall. R. J., (1951), “Protein measurement with the folin phenol reagent , J. Biochem., 193, pp. 265-270. 21 Martin, M. E., Byers, B. B., Olson, M. o . J., Salin, M. L., Arceneaux, J. E. L.,
(1986) “A Streptococcus mutans Superoxide dismutase that is active with either manganese or iron a cofactor”, J. Biol. Chem., 261, pp. 9361-9367. 22 Me Cord J. M., Fridovich, I., (1969), “Superoxid dismutase an enzymic
funtion for erythocuprein”, J. Bio. Chem., 244, pp. 6049-6055.
23 Morre, D. J., Bridge, A., Wu, L. Y., Morre, D. M., (2000), Preferential inhibition by (-)-epiGa/locatechin-3-Gfl/late of the cell surface NADH oxidase
and growth of transformed cells in culture”, Biochem. Pharmacol., 60(7), pp. 937-946.
24 Moưe, D. J., Morre, D. M., Temes, p., (2003), “Auxin-activated NADH oxidase activity of soybean plasma membranes is distinct from the constitutive plasma membrane NADH oxidase and exhibits prion-like properties”, In Vitro. Cell. Dev. Biol. Plant., 39(4), pp. 368-376.
25 Moire, D. J., Penel, c ., Greppin, H., Morre, D. M., (2002), “The plasma membrane-associated NADH oxidase of spinach leaves responds to blue light”, Int. J. Plant. Sci„ 163(4), pp. 543-547.
26 Mottola, H. A., Simpson, B. E., Gorin, G., (1970), “Absorptiometric Determination of Hydrogen Peroxide in Submicrogram Amount with leuco crystal Violet and Peroxidase as Catalyst”, Analytical Chemistry., 42, pp. 410 -411.
27 Ozturk, R., Bozkaya, L. A., Atav, E., Tarhan, L., (1999), “Purification and characterization of superoxide dismutase from Phanerochaete chrysoporium”, Enzyme and Microbial Technology., 25, pp. 392-399.
28 Poole, LB. and Claiborne, A. 1986. Interactions of pyrimidine nucleotide with redox forms of the flavin - containing NADH peroxidase form from
Streptococus faecalis. J. Biol. Chem. 216: 14525 - 14533.
29 Susanne, H., Erich, F. Elstner., (1999), "Transition metal ion-catalyzed oxygen activation during pathogenic processes", FEBS Letters., 443, pp. 1-7
30 Thibodeau, E. A., Keefe, T. E., (1990), “pH-dependent fluoride inhibition of peroxidase activity”, Oral Microbiol. Immunol., 5, pp. 328-331.
31 Tomomi, Ookawara et al., (1997), “Purification and Subunit Structure of Extracellular Superoxide Dismutase from Mouse Lung Tissue”, Arch.