3. Kết quả và thảo luận
3.5Sự phân giải 2,4D
2.4D là một trong chất trừ cỏ dại có cơ chế tác dụns theo kiểu bát chước hoạt động của auxin như IAA. Lợi dụng đặc tính kích thích sinh trường thực vật.nhiều người trồng rau ờ nước ta đã phun 2,4D với liều lượng thấp khiến rau trở nên xanh non giả tạo đánh iừa người tiêu dùna. Tuy nhiên, cũng như các chất chlorophenoxy khác 2.4D là chất độc đối với con người. Nhiều vụ ngộ độc rau do phun 2.4D đã xảy ra ở nước ta. Thêm vào đó. thời 2ian tự phân huv cúa 2.4D kéo dài tới 3 tháng [9]. Như vậy cũng có nghĩa là dư lượng chất diệt cỏ nàv tổn tại trong rau và đất canh tác là vấn đề rất đáng lo ngại. Tuy chưa sưu tầm được tài liệu về khả năng phân giải 2,4D của A zotobacter nhưng chúng tôi đã nhận được những bài báo viết vể khả nâng phân giải TCP của loại vi khuẩn nàv. Xuất phát từ cơ sờ đó chúna tôi đã đăt thí nghiệm tìm hiểu khả năng phàn giải 2.4D của các chủng Azotobacter phân lập được. Chủng 86.2 có một số đặc tính giống như ở A.chroococcum và có khá nãng sinh trường trẽn môi trường với benzoat-Na là nauổn cacbon duy nhất được sừ dụng trona thí nghiệm này.
Hình 6. Lựa chọn các chủng có khả nãng sinh trưởng trên iMT B có bổ sung 200 mg 2,4D/lít
Về khả nâng phân giải 2.4D thương phẩm của chủng 86.2 chúng tôi nhận thấy với hàm lượng 200m g/lít 2.4D là nsuổn cacbon duy nhất các chúng đều sinh trường kém. Việc bổ sung 5. 10, 15. 20s/lít glucoza tạo điểu kiện tốt cho tế bào phát triển và lượng 2.4D còn sót lại tương ứna VỚI lượng glucoza bổ sung nói trẽn là 179.5; 127,7; 145.8; 156.9 mg/lít. Phổ hấp phụ cùa 2.4D trong các mẫu nuôi cấy quét trên thiết bị tử ngoại - khả biến - hổng ngoại gần được trình bày ớ các hình 7a. 7b, 7c.
lá.
Wavelength (nm.Ị
H ình 7b. Độ hấp phụ của 2.4D trong mẫu nuôi cấy có bổ sung glucoza 5g/l (hàm lượng 2,4D còn lại là 179.5mg/l)
Wavelength (nm.)
Hình 7c. Độ hấp phụ của 2,4D trong mẫu nuôi cấy có bổ sung glucoza 10g/l (hàm lượng 2.4D còn lại là 127,7mg/l)
Wavelength Ịnm.Ị
Hình 7d. Độ hấp phụ của 2,4D trong mẫu nuôi cấy có bổ sung glucoza 20g/l (hàm lượng 2,4D còn lại là 156.9mg/l)
Qua các kết quả trên chúng tôi nhận thấy chùng 86.2 có khả năng phân giải
2,4D . K hi 10 g/1 glucoza được thêm vào môi trường, lượng 2,4D còn sót lại là thấp
nhất. Tuy hoạt tính khòng mạnh như ở các chi Pseudomonas, A lcaligenes... nhưng
đây là m ột đặc tính quý của chùng Azotobacter mà chúng tõi phân lập được.
Để chứng minh sự có mật của các chất kích thích sinh trưởng thực vật có trong dịch nuôi A zotobacter, chúng tôi đã tiến hành các thử nghiệm sinh học (biotest) tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam. Kết quả được trình bàv
ở các mục dưới đây:
3.6. Ánh hường của dịch nuôi đèn sự nẩy mầm của hạt ngỏ
Sau khi xử lý và ngâm ủ với dịch nuôi cấy pha loãng 5%, chúns tôi nhặn thấv dịch nuỏi các chủng 86.2. 76.1. 20.2 đểu kích thích sự nảy mầm của hạt ngô (bána 7 và hình 8). Với ngò lai ĐK.888 tý lệ náy mẩm tâng từ 8,57 đến 14,29% so với đối chứng không ngâm ù với dịch vi khuẩn. Tỷ lệ nảv mầm ờ nsô tẻ p . l l tăng 5.71%. Đặc biệt ớ chủng 86.2 làm tảng sự náy mầm của hạt n2ô lai ĐK.888 lên 2.86% so với chủng AT. 19.
Bàng 7. Ánh hường của dich nuòi Azotobacter spp. đến sự nàv mám của hạt ngò. Chủng Tý lệ nảy mầm (%) Ngỏ lai ĐK.888 N 2Ỏ té P. 1 1 Đối chứng (HịO) 48.57 94.29 86.2 62.86 100 76.1 57.14 100 20.2 60.00 100 AT. 19 60.00 100 26
86.2 Đối chứng AT. 19
Hình 8. Anh hường cùa A zotobacter lên sự nảy mầm cùa hat nsô lai ĐK. 888
3.7. N ăng suất và chát lượng rau cài tráng khi được bón thèm A zotobacter sp.
T hí nghiệm được tiến hành ớ qui mô châu vại tại Viện khoa học kĩ thuật nòng nghiệp Việt Nam. Ngoài nền phàn NPK. mỗi châu đươc bón thèm 107 CFU
A zotobacter sp. Sau 45 ngày, năng suất cũng như chất lượna rau cái trắng đươc kiếm tra. Kết quả được nẽư trong bảna 8. 9 và hình 9.
Bảng 8. Năng suất rau cải tráng khi được bón thèm Azotobacter sp.
Chủna
Vụ đông xuân Vụ hè thu
S6 lá/chậu ’ Khối lượn a tươi thân lá (g/chậu) Tích luỹ chất khỏ (%) Sớ lá/chậu Cao cày (cm) Khối lương tươi thân lá (g/chậu) Tích luỹ chát khô (%) Đối chứng 49,0 90.2 5.86 33.3 22.5 108.3 5.81 86.2 53,7 121,9 6.63 34.7 23.3 126.7 6.33 76.1 49.0 141.5 6.33 35.3 22.4 110.0 6.25 20.2 49.7 110.0 5,98 33,0 22.6 120.0 1 6.02 AT. 19 50.3 121.9 6.32 33.7 23.6 108.7 6.55
ở cả hai vụ đông xuân và hè thu, công thức bón chủng 86.2. 76.1. 20.2 đều cho nãng suất cao hơn cõng thức đối chứng (không bón A zotobacter) và tương đương với công thức bón chùng AT. 19 (chủng đối chứng). Chất lượng rau cải trắng được bón thêm Azotobacter sp. được trình bày ở bảng 9.
Bảng 9. Chất lượng rau cải tráng được bón thèm Azotobacter sp.
Chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Vụ đông xuân Vụ hè thu
Đuờng tổng số(%) Vitamin c (mg/100g) N 0 3- (mg/kg) Đường tổng sò' (%) Vitamin c (mg/100g) N 0 3- (mg/kg) Đối chứng 0.92 70.37 2.745 0.96 62.91 2,270 86.2 1.04 78,17 2.095 1.36 64.52 1.908 76.1 1.16 72.47 2.106 1.28 69.50 1.741 20.2 1.02 70.64 2.609 1 1.24 63.45 ’ 2.332 AT. 19 1.06 72.65 2.132 1.20 62.24 1.784
Theo kết quả phân tích của Trung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn hoá chất lượng nồng sản thuộc Viện sau thu hoạch, chất lượnă rau ớ các còng thức bón 86.2. 76.1. 20.2 đều rất tốt. Đạc biệt hàm lượng nitrat ờ các công thức bón chủng 86.2 và 76.1 thấp hơn rau đối chứng.
4. K ẾT LUẬN
1. V iệc hong khô đất làm tăng tính chọn lọc khi phàn lập Azotobacter. Loại vi khuẩn này chỉ được phát hiện ở các mẫu đất có pH từ 5,15 đến 7,75.
2. Ba chủng A zotobacter kí hiệu 86.2, 76.1, 20.2 sinh trường tốt trẽn môi trường nhân tạo và có hoạt tính ARA cao hơn so với chủng đối chứng là A. chroococcum
AT 19 từ 17,0 - 56,78 nM C2H4/ml/h. Sinh tổng hợp IAA của ba chùng nàv cao hơn chủng nhập nội A.chroococcum AT. 19 từ 0,44 đến 2.37 us/m l.
3. Chủng 86.2 có khả năng phàn giải chất diệt cò 2.4D. Hoạt tính tuy chưa cao nhưng là m ột điểm rất đáng được chú ý.
4. Cả 3 chủng thí nghiệm đều kích thích sự này mầm cúa hạt ngô lai ĐK.888 và n2ỏ té p .l 1 cũng như làm tăng năng suất và cải thiện chất lượns rau cải trắng.
5. Có thể sử dụng cả 3 chúng này đê’ sản xuất phàn bón vi sinh vật sau khi đươc đánh giá hoạt tính trên qui mô lớn hơn.
5. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Vũ Hài, Trần Qúi Hiển (2001), N ghê làm vườn, tái bản lần thứ nhất, Nxb Giáo dục, tr. 82 - 85.
2. Trần Quang Hùng (1991), Thuốc trừ dịch hại bảo vệ câv trổng, Cục trổnơ trọt và bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và CiNTP , tr. 128 - 142.
3. Vũ Văn Vụ, Hoàng Đức Cự, Vũ Thanh Tâm. Trần Vãn Lài (1997). Sinh lý học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
Tiếng Anh
4. Cox c . (1999). "2.4D: T oxicoloav”. J. pesticide reform / spring, 19. pp. 1 4 - 19.
5. Diab A.. Gounain M. Y. (1984). ’‘Distribution of Azotobacter. Actinomyceres. Cellulose - desradina. Acid - producing and Phosphate - dissolving bacteria in desert and salt march soil of Kuvvaite", Zbl. Mikrobiol.
139, pp. 4 2 5 - 4 3 3 .
6. Essavvy El. A. A.. Saved El. M., M oham ed Y. A. H.. Shanshourv El. A. (1984). "'Effect of com bined nitrogen in the production of plant growth regulation bv A zotobacter chroococcum ". Zbl. M ikrobiolo, 139, pp. 327 - 333.
7. Gonzles Lopez J.. Salmerson V.. Monero J., Cormenaza - Kamoz A. (1983), “Am ino acids and vitamins produced by Azotobacter vinelandii ATCC 12837 in chem ically - defined media and dialycsed soil media". Soil Biol. Biochem..
15, pp. 711 - 713.
8. Ishizawa s., Suzuki T.. A raragi A. (1975). “Effect of soil on Nitrogen fixation by Azotobacter vinelandii". Nitrogen fixa tio n and Nitrogen cycle. 12. pp. 61 - 6 7 .
9. K laasen c . D., W atkins m J. B. (1999), Casarett and D oull's toxicology - the basic science ofp o isio n , 5th. Me Graw - Hill. pp. 561 - 564.
10. Latus M „ Seitz H. J., Eberspacher J. V., Lingen R. (1995), "Purification and Characterization of H ydroxyquinol 1,2 - dioxygenase from Azotobacter sp. Strain GP 1", A ppl, Environ. M i c r o b i o l61. pp. 2453 - 2460.
11. Lee M ., Breckenridge c .. Knowles R. (1970). “Effect of some culture conditions on the production of indol - 3 - acetic acid and gibberellin - like
- substance by Azotobacter vinelandii". Can. J. M icrobiol., 16. pp. 1325 -
1330.
12. Li D. Y.. Eberspacher J.. W agner B., Kuntzer J.. Linaens F. (1991). " Degradation of 2,4,6 - trichlorophenol by Azotobacter sp. Strain GP 1", Appl. Environ. M icrobiol.. 57, pp. 1920 - 1928.
13. M ishustin E. N., Shilnikova V. K. (1969), “Free - living nitrogen - fixing bacteria of the genus A zotobacter", Soil Biology. UNESCO, pp.72 - 124.
14. M isra s., Kaushink B. D. (1989), Growth prom oting subtances o f Cyanobacteria. II. Detections o f amino acids, sugars and auxins. Proc. Indian nant. Sci. Acad, 55, pp. 499 - 504. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15. R udnick p.. Meletzus D.. Green A., He L.. Kennedy c . (1997), "Regulation of nitrogen fixation by ammonium in diazotrophic species of proteobacteria".
Soil biol. Biochem., 29. pp. 831-841.
16. Sharma p. K.. Chahal V. p. s. (1985 ). "The effect of amino group acceptors on the production of indolyl acetic acid from trvptophan by Azotobacter",
M i c r o b io l. . 55, pp. 1041 - 1043.
17. Sưbba Rao N. s. (1980), A zotobacter inoculant”. Bioffertilizers in Agricultures, 2Ih. Oxford and TBH publishing Co.. pp. 77-79.
18.Tchan Y. T.. Peter D. (1984), “Genus Azotobacter" , Bergey's manual o f system atic BũCteriology. W illiams W ilkins - Baltimore - London, pp. 221 — 231.
Đ Ạ I H ỌC Q U Ố C G IA H À NỘ I T R U Ồ N G Đ Ạ I 11ỌC K H O A Ỉ1ỌC T Ự N H 1Ê N
K H O A SIN H HỌC
H oàn g T h ị L an A n i l
PH Â N LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG
AZO TO B A CTE R CÓ ĐẶC TÍNH SINH HỌC QUÍ
K H O Á LUẬN T Ố T N G H IỆ P HỆ Đ Ạ I H Ọ C C H ÍN H Q U Y N gành: Công ngliệ sinh học
C án bộ hướng dẫn: T S . N gó T ự T h à n h
TẠP CHÍ
DI TRUYỀN HỌC & ÚNG DỤNG
GENETICS AND APPLICATIONS
ISSN : 0866-8566
144 Xuân Thuỷ, Hà Nội. Tel: 7540602, 7680747; Fax: 7540602
Nhận của ồng fail.) A / 6 Ổ _ / „
Cơ quan : fCfarz &K& - 7 ^ 7» * ‘p
b c t ' : - 6 ẹ c c t ã m ọ + ề * ' c f j y t ' GIẤY BIÊN NHẬN Số tiền : V ề khoản : Bằng chữ:
Hà Nôi, ngày Vé tháng A5năm 2(xx3 Tổng biên tập
ĐẬC TỈNH SINH HỌC CỦA M ỘT s ố CHỦNG AZOTOBACTER
NGÔ T ự THÀNH , v ũ THỊ MINH ĐỨC
_ Trường Đ ại học K hoa học T ự nhiên H à N ội
NGUYỄN THU HÀ, NGUYỄN NGỌC QUYÊN
V iện K hoa học K ĩ thuật N ông nghiệp Việt N am
H iệu quả tốt của việc xử lý hạt bằng huyền dịch A zotobacter trước khi gieo trổng đã được ohi nhận từ lâu [8]. Sở đ ĩ như vậy là do Azotobacter có khả năng c ố định nitơ, tiết vào mòi ưường các vitamin axit arain cũng nh ư các ch ất kích thích sinh trường thực vật (axit indol axetic, gibberelic) [5 8]
G ần đây m ột số tác giả [4, 6] đã phàn lập' tinh c h ế và mò tả một so đạc tính cua enzim từ
Azotobacter sp. G D I.c ó k h ả nãng phản giải 2,4, 6 - trichlorophenol (một hợp chất độc, <?ày b c h thích tac nhân gày ung thư, nguy hiểm đối với m òi trường sống). N ghiên cứu này nhằm vào các đạc tính sinh học cùa một số chủng A zo to b a cter m ới phần lập, có so sánh với A. chroococcum AT19 nhặp nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I. VẬT LIỆ U VÀ P H Ư Ơ N G PH Á P
Vi sinh v ậ t: A -o to b a cter chroococcum AT19 nhập nội được sừ dụng làm chủng đối chứng. Các chùng
Azorobacter được phân lập từ đất cùa các vùng chuyên canh rau màu, trẽn mỏi trương Burk. Việc phán lập được tiến hành với hai lò đất: lô được giữ nguyên độ ẩm ban đáu và lõ được hong khò ờ nhiệt độ phòng roi nghiền mịn.
Xác định khả năng cố định nitơ
K hả năng này được xác định bẳng cách đo hoạt tính nitrogenza theo phương pháp khử axetylen trẽn m áy sắc ký kill PY E U N IC A M series 204 chrom atograp (Anh).
Xác định axit indol-3- axetic (IAA)
T iến hành theo chi dản cùa [7], C hùna được cấy vào bình nón chứa 50 ml mòi trường Burk có chứa cryptophan 0.1% , nuòi trèn m áy lắc 200 vòng/phút ớ 30°c trong 5 ngày. Li tàm loại bò tế bào. Lấy 2 ml dịch ư o n g thèm vào ống nghiệm chứa sẩn 8ml thuốc thừ Salkowski cải tiến, lắc đểu. Để ở nhiệt độ phòng 30 phút. So m ẩu ớ bước sóng 530 nm. H àm lượng IAA đuợc tính toán dựa theo đổ thị chuẩn.
Xác định khả nâng phàn giải 2,4 d ichlorop henoxyacetate (2.4D)
Trước khi cấy vi khuần. 200 mg 2,4D được thèm vào 1 lít môi trường vò trùng cỏ hàm lương glucoza ờ các mức 0. 5, 10. 15, 20 g/lít. N uôi lắc 200 vòng/phút trong 5 ngày. Li tám lạnh 6500 vòns/phút trong 15 phút. D ịch trong dược lọc qua phiến lọc khuãn 0.2 u m vô trùng để loại hết tế bào còn sót lại. Đo phố hấp phụ trèn thiết bị từ ngoại - khả biến - hổng ngoại gần ( u v - VIS - NIR - Scanning spectrophotom eter u v 3101 PC) (Shim adzu - Jp). Đối chứng là dịch nuôi vi khuán nhung khòng bổ sung 2.4D và dịch m ôi trường có bò sung 2,4D nhưng khòng cấy vi khuấn. Hàm luợng 2.4D được tính theo đồ thị chuấn đã xác định trẽn m áy ờ bước sóng 283 nm [1].
Xác định ảnh hưởng của dịch nuòi A zotobacter spp. tới sư này mám ờ hạt ngõ
H ạt aiống ngô té p. 11 và ngò lai ĐK .888 được khử trùng bầng HgCl: 0,1% trong 4 phút. Rửa lại bầng nước cất vô trùng nhiều lần. N gâm hạt ưong nước cất vô trùng từ 3 dên 4 giờ. Sau đó ù hạt với dịch vi sinh vặt đã li tâm loại bỏ tế bào (pha loãng tý lệ 5% ) ờ 30uc trong 2 ngày.
Thí nghiệm ờ quv mò ch ặu vại với rau cái tráng
T hí nghiêm được tiến hành trong 2 vụ đông xuân và hè thu. Mỗi chậu chứa 7kg đất. Nèn phân bón 40 N: 80 P ;0": 40 K ,Ô . Công thức thí nghiêm đươc bón thèm 107 tế bào Azotobacter /chậu. Thí nghiệm được lap lại 3 lẩn. Sau 45 ngày ưổng, thu hoach và dánh giá theo các chi tiêu: số lá/chậu, khối liron® tươi than la chiểu cao cày, % vật chàt khỏ. Hàm lương vitamin c , đường tổng sô và hàm lượng NCV được xác định tại T rung tâm kiểm tra và tiêu chuẩn hoá chất lương nòng sản thuộc Viên sau thu