Cỏc mẫu DNA được tỏch chiết từ mỏu ngoại vi theo phương phỏp Phenol/chloroform
Nguyờn tắc cơ bản bao gồm cỏc bước: Loại hồng cầu và phỏ vỡ màng tế bào Phỏ vỡ màng nhõn Loại protein Tủa DNA Rửa tủa Hũa tan DNA
Quy trỡnh cụ thể:
- Mỏu tươi chống đụng EDTA cần tỏch trong vũng 24 giờ.
- Cho 0,5 mL mỏu tươi toàn phần chống đụng bằng EDTA vào ống Eppendof 1,5 mL, thờm vào 0,5 mL dung dịch Lysis buffer rồi ủ trờn đỏ trong 10 phỳt.
- Ly tõm 8000 vũng/ phỳt trong 10 phỳt ở 4oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn. quỏ trỡnh này được lặp lại 3 lần.
- Cho vào 0,5 mL dung dịch K , ly tõm 10 phỳt tốc độ 8000 vũng/ phỳt ở 4 oC, loại bỏ dịch nổi và thu cặn.
- Cho 0,5 mL Lysis buffer; 12,5 àL SDS 10%; 10 àL proteinase K, sau đú ủ 2h ở 56 o
C.
- Cho 0,5 mL phenol: chloroform: isoamyl, ly tõm 10000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o
C, hồn hợp được chia làm 3 phần: lớp dung dịch phớa trờn cú chứa DNA, lớp ở giữa là cặn tế bào, lớp dưới cựng là dịch chiết. Hỳt lấy phần dịch chứa DNA trờn cựng.
- Cho 0,5 mL chloroform:isoamyl, ly tõm mẫu ở 10.000 vũng/phỳt trong 10 phỳt ở 4 o
C, hỳt lấy phần dịch trờn cựng.
- Tủa DNA bằng 1 mL cồn tuyệt đối, cho thờm 50 àL sodium acetat, để lạnh ở -20 oC trong 4 giờ.
- Ly tõm 13.000 vũng/phỳt trong 20 phỳt ở 4 oC, đổ dịch nổi phớa trờn, thu tủa.
Phương phỏp quang phổ
Nguyờn lý đo mọ̃t độ quang học
- Acid nucleic cú phổ hấp phụ cực đại ở bước súng 260 nm là do sự cú mặt của base purin và base pyrimidin. Giỏ trị mật độ quang ở bước súng 260nm (OD260nm) của cỏc mẫu cho phộp xỏc định nồng độ acid nucleic cú trong mẫu nghiờn cứu.
- Protein hấp thụ ỏnh sỏng tử ngoại ở bước súng 280nm do sự hấp thụ của cỏc acid amin nhõn thơm và dị vũng, bao gồm: tyrosin, tryptophan và phenylalanin.
- Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm để kiểm tra độ tinh sạch của DNA. Nếu OD260nm/OD280nm = 1,8 2 thỡ DNA được coi là tinh sạch.