Phương pháp chiết siêu âm là phương pháp chiết ngâm dầm (maceration) cổ điển kết hợp với siêu âm được sử dụng trong đề tài. Phương pháp này không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thực hiện thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây (hoặc nguyên liệu được cắt nhỏ) trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc bình thép không rỉ, bình có nắp đậy. Rót dung môi tinh khiết vào bình cho đến xấp xấp mặt của lớp nguyên liệu. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc màng tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịch chiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, thu hồi dung môi sẽ có được cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mới vào bình chứa nguyên liệu và tiếp tục chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Trong quá trình chiết có thể trộn, đảo nguyên liệu để chúng thấm đều với dung môi, tăng hiệu quả khi chiết.
2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ[6]
Sắc ký là phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gốm nhiều hợp chất ra riêng thành đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất đó đối với hệ thống (hệ thống gồm hai pha: pha động và pha tĩnh).
2.2.1. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG
Sắc ký bản mỏng (TLC – thin layer chromatography) hay còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp thu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi đi ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ (silicagel, Al2O3). Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm.
Bình sắc ký: bằng thủy tinh, trong suốt, có nắp đậy.
Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0,25 mm của một loại chất hấp thu (silicagel, Al2O3) được tráng thành một lớp mỏng, đều phủ lên một nền phẳng như một tấm kiếng, tấm nhôm. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ CaSO4 khan hoặc tinh bột, polyme hữu cơ.
Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp với nhiều hợp chất có độ phân cực khác nhau, sử dụng khoảng 1μL dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2-5%, dùng một vi quản chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình.
Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm trên tấm bản mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với những vận tốc khác nhau, phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy thuộc vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silicagel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và hợp chất rất phân cực sẽ di chuyển chậm.
2.2.2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
Sắc ký cột dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu. Pha động là chất lỏng, pha tĩnh là các hạt silicagel.
Ở phương pháp sắc ký này, các chất của hỗn hợp sẽ hấp thu hoặc dính lên bề mặt của pha tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp thu khác nhau lên pha tĩnh và chúng cũng phụ thuộc vào tính chất của pha động. Kết quả là trong quá trình pha động di chuyển chúng sẽ tách nhau ra.
Trong sắc ký cột hấp thu pha rắn thường là những hạt silica gel. Trên bề mặt những hạt này có mang nhiều nhóm -OH nên đây là những pha tĩnh có tính rất phân cực. Sự hấp thu xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực, do sự tương tác giữa những phân tử có mang những nhóm phân cực đối với pha rắn là chất rất phân cực.
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHỔ
Sử dụng các phương pháp phổ để có thể xác định được cấu trúc của các chất hữu cơ.
Cho thông tin về các proton 1 H có trong phân tử. Các thông số của phổ 1 H NMR cho biết độ dịch chuyển hóa học, hình dạng tín hiệu và hằng số tương tác (J) spin-spin giữa các proton không tương đương nhau sẽ cho các kiểu ghép vân phổ khác nhau, tích phân cường độ của tín hiệu thể hiện số lượng proton tương ứng với tín hiệu đó.
PHỔ 13
C-NMR
Cho thông tin về độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phân tử. Các tín hiệu phổ 13 C-NMR xuất hiện trong khoảng thang chia độ rộng (0-240 ppm) nên các tín hiệu tách rõ ràng, mũi đơn dễ quan sát. Mỗi loại carbon trong hợp chất hữu cơ có độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào độ dịch chuyển hóa học của carbon trong phổ 13 C-NMR , có thể dự đoán được loại carbon và liên kết của carbon đó[7].
Phổ 13
C-NMR DETP cũng là một dạng phổ 13
C-NMR, theo kỹ thuật đo này người ta thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau, lần đầu (DEPT-45) sẽ thu được phổ với đầy đủ tín hiệu của các carbon. Trong lần đo thứ hai thực hiện ngay sau đó, (DEPT- 135), những carbon metin (-CH<), và methyl (-CH3) cho tín hiệu xuất hiện ở phía trên (cường độ dương) còn tín hiệu của carbon metylen (-CH2-) cho tín hiệu ở phía dưới (cường độ âm). Ở lần đo thứ ba (DEPT-90), chỉ có những carbon metin (-CH<) mới cho tín hiệu phổ[4]
.
PHỔ COSY 1
H -1H[4]
Phổ Cosy 1
H -1H, là phổ tương quan proton- proton, dùng thay thế kỹ thuật khử ghép proton trong phổ một chiều, cho biệt proton nào trong phân tử đã tương tác spin- spin với nhau.
PHỔ HSQC VÀ HMBC[4]
Khảo sát hạt nhân 1H ghép cặp với 13 C
Phổ HSQC là phổ hai chiều cho thấy sự tương tác giữa tín hiệu carbon và tín hiệu proton gắn trực tiếp với nó.
Phổ HMBC cho thấy sự tương tác của các tín hiệu carbon với tín hiệu proton ở cách nhau hai hoặc ba liên kết
Phổ khối lượng hay còn gọi là phổ khối là một phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất nghiên cứu trước tiên được hóa hơi trong điều kiện chân không cao, sau đó được ion hóa và phá thành các mảnh nhờ những va đập điện tử. Cấu tạo của hợp chất nghiên cứu được xác định thông qua việc nghiên cứu khối lượng và điện tích các mảnh cùng với xác suất xuất hiện của mảnh đó.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM