III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3.2.2. Cây phát sinh loài đối với các loài digenea dựa vào trình tự gen 28S rDNA
Tương tự với monogenea, cây phát sinh loài dựa vào trình tự của 16 loài digenea với 3 loài trong nghiên cứu hiện tại và 13 loài trên Genbank. Thông tin các trình tự được trình bày trong Bảng 3.10.
Bảng 3.10. Thông tin các trình tự digenea sử dụng trong nghiên cứu
Loài ký sinh trùng Tác giả Vị trí Mã số
GenBank
Allocreadium sp. Nghiên cứu hiện tại Khánh Hòa
Bucephalus sp. Nghiên cứu hiện tại Đồng Tháp
Prosorhynchoides sp. Nghiên cứu hiện tại Cần Thơ
Rhipidocotyle campanula GB Petkeviciute và ctv (2013) Ukraina KF184356 Rhipidocotyle fennica GB Stunzenas và ctv (2014) Lithuania KM068119 Bucephalus polymorphus GB Petkeviciute và ctv (2012) Lithuana JQ346717 Prosorhynchoides ozakii GB Baha và ctv (2011) Nhật Bản AB640885
Allocreadium isoporum GB Petkeviciute và ctv (2010) Nga GU462126 Allocreadium markewitschi GB
Curran và ctv (2006) Hoa Kỳ EF032693
Clonorchis sinensis GB
Lee và ctv (2007) Unknown EF654661
Centrocestus formosanus GB Thaenkham và ctv (2011) Thái Lan HQ874609 Haplorchis pumilo GB Thaenkham và ctv (2010) Thái Lan HM004191 Haplorchis yokogawai GB Thaenkham và ctv (2010) Thái Lan HM004192 Haplorchis taichui GB Thaenkham và ctv (2010) Thái Lan HM004187 Metorchis orientalis GB Ai và ctv (2010) Trung Quốc HM347224 Procerovum varium GB Thaenkham và ctv (2010) Thái Lan HM004182 Procerovum cheni GB Thaenkham và ctv (2010) Thái Lan HM004179
Xây dựng cây phát sinh loài theo phương pháp Maximum Likelihood (Phần mềm MEGA ver. 6) và trình tự tương đồng được thể hiện trong Bảng 3.11. Kết quả xây dựng cây phát sinh loài ở Hình 3.16.
Bảng 3.11. Trình tự tương đồng của các loài digenea 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 0,970 0,967 0,898 0,897 0,871 0,872 0,820 0,838 0,818 0,819 0,818 0,815 0,816 0,828 0,828 2 0,997 0,902 0,903 0,869 0,872 0,814 0,833 0,816 0,813 0,812 0,808 0,809 0,829 0,832 3 0,904 0,906 0,871 0,875 0,813 0,833 0,816 0,813 0,812 0,808 0,809 0,832 0,834 4 0,998 0,946 0,945 0,827 0,825 0,820 0,820 0,818 0,815 0,816 0,886 0,888 5 0,945 0,944 0,828 0,826 0,822 0,822 0,819 0,816 0,817 0,885 0,887 6 0,994 0,834 0,835 0,822 0,825 0,819 0,819 0,820 0,928 0,925 7 0,833 0,832 0,822 0,825 0,819 0,819 0,820 0,922 0,920 8 0,943 0,920 0,927 0,925 0,933 0,934 0,835 0,834 9 0,922 0,929 0,932 0,935 0,937 0,835 0,830 10 0,954 0,964 0,961 0,960 0,822 0,824 11 0,961 0,982 0,981 0,828 0,830 12 0,970 0,971 0,829 0,829 13 0,998 0,829 0,832 14 0,830 0,833 15 0,988 16
***Chú thích: 1. Allocreadium isoporum GB, 2. Allocreadium markewitschi GB, 3.
Allocreadium sp., 4. Prosorhynchoides ozakii GB, 5. Prosorhynchoides sp., 6.
Rhipidocotyle campanula GB, 7. Rhipidocotyle fennica GB, 8. Centrocestus formosanus
GB, 9. Clonorchis sinensis GB, 10. Haplorchis pumilio GB, 11. Haplorchis taichui GB, 12. Haplorchis yokogawai GB, 13. Procerovum cheni GB, 14. Procerovum varium GB, 15. Bucephalus sp., 16. Bucephalus polymorphus GB.
Các loài digenea được sử dụng trình tự gen 28S rDNA có sự khác biệt dao dộng trong khoảng 0,2 – 19,2 % (Bảng 3.11) . Loài Allocreadium sp. trong nghiên cứu hiện tại có quan hệ gần gũi với với loài Allocreadium markewitschi trên Genbank (sự khác biệt trình tự là 0,3%) dù nằm trong cùng một nhánh nhưng chúng thể hiện là 2 loài khác nhau thuộc cùng một giống (BT 98%). Tương tự đối với loài Prosorhynchoides sp. và Bucephalus sp. (sự khác biệt trình tự là 0,2 % và 1,2%).
Hình 3.16. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea
***Chú thích: Sử dụng phần mềm MEGA 6.1 (bootstrap 1000) với thuật toán Maximum Likelihood. Loài có kí hiệu GB được lấy từ GenBank. Metorchis orientails được sử dụng làm nhóm ngoại.
Cây phát sinh loài trình tự gen 28S rDNA của các loài digenea (Hình 3.16.) được chia làm 2 nhóm chính. Nhóm 1 gồm 2 nhánh nhỏ: nhóm 1.1 gồm các loài thuộc họ Bucephalidae, nhóm 1.2 gồm các loài thuộc họ Allocreadiidae. Nhóm 2 bao gồm các loài thuộc họ
Opisthorchiidae, Heterophyidae và được chia thành 2 nhóm nhỏ: nhóm 2.1 gồm các loài
thuộc giống Haplorchis và Procerovum , nhóm 2.2 gồm các loài thuộc giống Centrocestus
và Clonorchis.
Nhiều báo cáo về sự đa dạng di truyền cũng như mối quan hệ phát sinh loài của các loài thuộc giống Allocreadium, Prosorhynchoides và Bucephalus riêng rẽ, nhưng đối với mối quan hệ phát sinh loài của 3 giống trên thể hiện chung trong cây phát sinh loài vẫn còn giới hạn. Olson và ctv (2003), tác giả đã xây dựng cây phát sinh loài của 163 loài digenea dựa vào gen 28S rDNA. Kết quả nghiên cứu cho thấy được mối quan hệ phát sinh loài cũng như mối quan hệ gần gũi của 77 họ digenea. Đồng thời thể hiện được các loài thuộc họ Bucephalidae không có quan hệ gần gũi với họ Allocrediidae. Hơn nữa, đối với giống Prosorhynchoides, tác giả cũng đã cho thấy được mối quan hệ gần gũi của giống này với giống Rhipidocotyle
hơn là giống Bucephalus. Kết quả này có điểm tương tự với kết quả trong nghiên cứu hiện tại, nhưng vẫn có sự khác biệt khi các loài thuộc giống Prosorhynchoides đều nằm cùng nhánh với các loài thuộc giống Rhipidocotyle và Bucephalus.
Đồng thời khi xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen ITS rDNA và 28S rDNA, Curran và ctv (2006) cũng cho thấy mối quan hệ gần gũi của loài thuộc giống Allocredium
với giống Prosthenhystera thuộc họ Callodistomidae hơn các họ khác khi phân tích mối quan hệ phát sinh loài. Besprozvannykh và ctv (2012) đã chỉ ra được mối quan hệ gần gũi của các loài thuộc họ Allocrediidae với họ Monochiidae và Lissorchiidae ở Nga.
Loài Clonorchis sinensis và Centrocestus formosanus thuộc cùng 1 họ Opisthorchiidae nhưng lại không nằm trên cùng một nhánh mà tách riêng ra cho thấy sự không phù hợp giữa phân loại dựa trên hình thái và di truyền. Hơn nữa, ở mức độ giống Haplorchis và
Procerovum cũng cho thấy sự thiếu phân tách dựa vào đặc điểm di truyền. Điều này chứng tỏ các loài này có quan hệ gần gũi với nhau.
KẾT QUẢ VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
Dựa vào các đặc điểm hình thái và di truyền, nghiên cứu đã phân loại được 13 loài ký sinh trùng (6 loài ngoại ký sinh trên mang, 7 loài nội ký sinh ở ruột) trên các loài cá nước ngọt. Trong đó, 7 loài ký sinh trùng được phân loại đến mức độ loài gồm Bothriocephalus acheilognathi, Thaparocleidus campylopterocirrus, Thaparocleidus vietnamensis, Thaparocleidus siamensis, Prosorhynchoides ozakii, Cucullanus chabaudi, Trianchoratus gussevi.
Tỉ lệ nhiễm và cường độ nhiễm có sự dao động giữa các loài và trên các vật chủ khác nhau. Tỉ lệ nhiễm cao nhất là loài Pallisentic sp. (81,67%) trên cá lóc đồng, cường độ nhiễm cao nhất là loài Thaparocleidus campylopterocirrus (7) trên cá mè vinh. Loài
Ichthyophthyrius sp. trên cá rô đồng có cùng cường độ nhiễm và tỉ lệ nhiễm thấp nhất (2,9% và 1).
Sử dụng đoạn gen 28S rDNA, nghiên cứu tập trung thực hiện xây dựng cây phát sinh loài cho 3 loài monogenea (Thaparocleidus siamensis, T. campylopterocirrus và
Trianchoratus gussevi) và 3 loài digenea (Bucephalus sp., Prosorhynchoides sp. và
Allocreadium sp.) trong nghiên cứu. Mục tiêu của việc xây dựng cây phát sinh loài nhằm khảo sát mối quan hệ di truyền của các loài ký sinh trùng trong nghiên cứu với các loài ký sinh trùng đã được ghi nhận trên cá nước ngọt. Kết quả cho thấy sự tương đồng của phân loại hình thái và di truyền ở các loài ký sinh trùng ghi nhận trong nghiên cứu. Vị trí trong cây phát sinh loài của các loài có độ chính xác cao. Tuy nhiên, các loài ấu trùng sán lá song chủ (Clonorchis sinensis, Centrocestus formosanus, Haplorchis spp., Procerovum
spp.) cho thấy sự thiếu phân tách dựa vào đặc điểm di truyền.
Qua những kết quả của nghiên cứu hiện tại cần có các kế hoạch thu mẫu với số lượng mẫu nhiều hơn, tiến hành thu tại nhiều khu vực và vào những mùa khác nhau để đánh giá đầy đủ sự biến động tỉ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và thành phần loài ký sinh trùng trên cá. Cần sử dụng thêm các chỉ thị phân tử khác để có thêm các căn cứ đánh giá chính xác hơn về mối quan hệ phát sinh loài.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt
1) Bộ Nông nghiệp & PTNT (2009). Kỹ thuật nuôi cá rô đồng (Anabas testudineus
Bloch, 1792). Nhà Xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
2) Bộ Thủy sản (2007). Một số loài cá nước ngọt thường gặp ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, tr. 42.
3) Bùi Quang Tề (2001). Ký sinh trùng của một số loài cá nước ngọt đồng bằng sông Cửu Long và các giải pháp phòng trị chúng. Luận án tiến sĩ. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
4) Đỗ Thị Hòa, Nguyễn Hữu Dũng, Bùi Quang Tề, Đỗ Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
5) Hà Ký & Bùi Quang Tề (2007). Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
6) Hà Ký, Bùi Quang Tề (2007). Ký sinh trùng cá nước ngọt Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
7) Nguyễn Chung (2000). Kỹ thuật sinh sản và nuôi cá tra. NXB Nông Nghiệp.
8) Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thụy Mai Thy, Nguyễn Thanh Phương và Đặng Thị Hoàng Oanh (2008). Khảo sát sự nhiễm ký sinh trùng trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở tỉnh An Giang. Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 1, 204-212.
9) Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hoà & Jong-yil Chai (2008). “Sán lá ruột ký sinh trên người ở Việt Nam”. FIBOZOPA, tr. 4.
10)Nguyễn Văn Đức và cộng sự (2011). Tình hình nhiễm ký sinh trùng ở cá sông Lam, huyện Đô Lương, tỉnh Nghệ An. Tạp chí Sinh Học, 33(3), tr. 9-14.
11)Nguyễn Văn Thường (2008). Tổng quan dẫn liệu về định loại cá Tra Pangasianodon hypophthalmus phân bố ở vùng hạ lưu sông Mê Kông. Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ.
12)Phạm Đình Văn (2010). Điều tra thành phần loài và xây dựng bộ mẫu về các loài cá có giá trị kinh tế trên địa bàn tỉnh Đồng Tháp. Luận văn thạc sỹ, Đại học Đồng Tháp.
bệnh trên cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh ở An Giang và Đồng Tháp. Tạp chí khoa học, Đại học Cần Thơ, 21b, 124-132.
13)Phạm Văn Khánh (2000). Kỹ thuật nuôi cá tra và cá basa trong bè. NXB Nông Nghiệp.
14)Quyết định 1291/QĐ-TTg. Quyết định: Phê duyệt Kế hoạch hành động phát triển ngành công nghiệp chế biến nông, thủy sản thực hiện Chiến lược công nghiệp hóa của Việt Nam trong khuôn khổ hợp tác Việt Nam-Nhật Bản hướng đến năm 2020, tầm nhìn 2030. Hà Nội, 01/08/2014.
15)Trần Nam Hà và Trương Thị Hoa (2011). Nghiên cứu một số bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra trên cá chẽm Lates calcarifer nuôi tại Thừa Thiên Huế và biện pháp trị bệnh. Trường Đại học Nông Lâm Huế.
16)Vũ Đặng Hạ Quyên, Đặng Thúy Bình, Đào Thị Hàn Ly và Phạm Thị Diệu Anh (2014). Nghiên cứu thành phần ký sinh trùng trên cá Tra Pangasianodonn hypophthamus, 1978 bằng phương pháp hình thái và di truyền. Tạp chí Sinh Học, 36(1se), 138-144.
Tài liệu Tiếng Anh
17)Ahmed và Ezaz (1997). Diversity of Helminth parasites in the freshwater catfish of Bangladesh. Department of Zoology, University of Dhaka, Dhaka- 1000, Bangladesh. 18)Andrea, I., Serge, M., Jobet, E., Gelnal, M., & Verneau, O. (2004). Molecular
phylogeny of congeneric monogenean parasites (Dactylogyrus): a case of intrahost speciation, evolution, 58(5), 1001-1018.
19)Anindo, C., Shuai, Z., Gerardo, P. D. L., Andres, M. A., Chase, B. & Eric, G. (2013). The invasive Asian fish tapeworm, Bothriocephalus acheilognathi Yamaguti, 1934, in the Chagres River/Panama Canal drainage, Panama. BioInvasions Records, 2(2), 99-104.
20)Ballard & Whitlock (2004). The incomplete natural history of mitochodrya.
Molecular Ecology. 13(4), 729 – 744.
21)Barakbah A. (2007). Encyclopedia of Midwife Melayu. Kuala Lumpur: Nona Roguy/Utusan Melayu Publications.
22)Benziger A, Philip S, Raghavan R, Anvar Ali PH, Sukumaran M, Tharian JC, Dahanukar N, Baby F, Peter R, Rema Devi K, Radhakrishnan KV, Haniffa MA, Britz R, Antunes A (2011). Unravelling a 146 years Old Taxonomic Puzzle: Validation of Malabar Snakehead, Speciesstatus and its relevance for Channid Systematics and Evolution. PloSONE, 6(6), e21272.
23)Besprozvannykh, V. V., Ermolenko, A. V., Atopkin, D. M. (2012). The life cycle of Asymphylodora perccotti sp. n. (Trematoda: Lissorchiidae) in the Russian Southern Far East, Parasitology International ,61, 235–241
24) Bhuiyan A. I., Bushra J. and Ghani O. (2014). Abundance and distribution of endoparasitic helminths in Anabas testudineus (Bloch, 1792) from a polluted beel of Bangladesh. Bangladesh J. Zool, 42(1), 1-10.
25)Binky K., M. Shomorendra and Devashish Kar (2011). Nematode Parasites of Karbhala Wetland in Silchar Assam. Biological Forum – An International Journal, 3(2), 18-21.
26)Chaiyapo M., Wongsawad C. and Wongsawad P. (2007). Diversity of helminths found in Channid fishes from Bung Boraphet. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 38, 191-193.
27)Chaudhary A. & Singh H. S. (2012). Phylogenetic study of nine species of freshwater monogeneans using secondary structure and motif prediction from India.
Bioinformation, 8(18), 862-869.
28)Chaudhary A., Verma C., Varma M. and Hridaya S. Singh (2014). Identification of
Thaparocleidus caecus (Mizelle & Kritsky, 1969) (Monogenea: Dactylogyridae) using morphological and molecular tools: a parasite invasion in Indian freshwater.
BioInvasions Records, 4(3), 195-200.
29)Choudhury, A., Zheng, S., León, G. P. De, & Martínez-aquino, A. (2013). The invasive Asian fish tapeworm , Bothriocephalus acheilognathi Yamaguti , 1934 , in the Chagres River / Panama Canal drainage , Panama. BioInvasion Records,2(2), 99– 104.
30)Curran, S. S., Tkach, V. V., Overstreet, R. M. A Review of Polylekithum Arnold 1934 and Its Familial Affinities Using Morphological and Molecular Data, with description of Polylekithumcatahoulensis sp. nov., Acta Parasitologica, 51(4), 238–248.
31)Dahlan-Daud CK, Mat Jais AM, Ahmad Z, Md Akim A & Adam A. (2010). Amino and fatty acids composition in haruan traditional extract. Boletin Latino-americano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromaticas, 9(5), 414- 429.
32)Das D. and Goswami M. M. (2014). Helminth infection in Anabas testudineus of three wetlands of Goalpara, Assam. Journal of Applied and Natural Science, 6(2), 677-679.
33)Dian, G., Gui, T. W., Bing, W. X., Wei, J. Y. & Pin, N. (2008). A New Species of
Allocreadium (Trematoda: Allocreadiidae) from Freshwater Fishes in the Danjiangkou Reservoir in China. Journal of Parasitology, 94(1), 176-180.
34)Dinh T.T., Kania P., Buchmann K. (2010). Infection of zoonotic trematode metacercariae in Sutchi catfish (Pangasianodon hypophthalmus) in Vietnam: Associations with season, management and host age. Aquaculture, 302, 19–25.
35)Dinh T.T., Buchmann K., (2008). Infections with gill parasitic monogeneans
Thaparocleidus siamensis and T. caecus in cultured Catfish Pangasius hypophthalmus in Southern Vietnam, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol, 28(1), 10-15.
36)Gam LH, Leow CY, Baie S. (2005). Amino acid composition of Snakehead fish (Channa striatus) of various sizes obtained at different times of year. Malaysian Journal of Pharmaceutical Sciences, 3(2), 19-30
37)Guarro, J., GenéJ, & Stchigel, a M. (1999). Developments in fungal taxonomy.
Clinical microbiology reviews, 12(3), 454–500.
38)Hassouna N., Michot B., Bachellerie J. P. (1994). The complete nucleotide sequence
of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large
subunit rRNA in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res, 12, 3563–3583.
39)Hisam U. Farooqi (1958). A new species of the genus Pallisentics from a fresh – water fish. Z. f. Parasitenkunde, Bd. 18, S. 457 – 456.
40)Hossain MK, Latifa GA & Rahman MM (2008). Observations on induced breeding of snakehead murrel, Channa striatus (Bloch, 1793). Int J Sustain Crop Prod ,3: 65-68.
41)Laetitia, P., Timothy, D., Littlewood, J., Olson, S., & Morand, S. (2004). Molecular phylogeny of gill monogeneans (Platyhelminthes, Monogenea, Dactylogyridae) and colonization of Indo-West Pacific butterflyfish hosts (Perciformes, Chaetodontidae),
Zoologica Scripta, 425-436.
42) Luangphai, P., Chalobol Wongsawad, Kanda Kumchoo and Pralongyrut Sripalwit (2004). Survey of helminths in climbing perch (Anabas testudineus) from San Sai District, Chiang Mai Province. Southeast Asian J Trop Med Public Health, 35, 288- 290.
43) Luangphai, P., Chalobol, W., Kanda, K. & Pralongyut, S. (2003). Survey Of Helminths In Climbing Perch (Anabas Testudineus) From San Sai District, Chiang
Mai Province. Department of Biology, Thailand, 288-290.
44)Mat Jais AM, Matori MF; Kittakoop P, Suwanborirux K. (1998). Fatty acid composition in mucus and roe of Haruan, Channa striatus, for wound healing.
General Pharmacology: The Vascular System, 30(4), 561-563.
45)Mekong River Commission (2013). A guide to larve and juveniles of some common fish species from the Mekong River Basin. MRC Technical Paper, 38, p.40.
46)Mohsin AK, Ambak MA. (1983). Freshwater fishes of Peninsula Malaysia. University Putra Malaysia, Serdang, Malaysia,157–161.
47)Nguyen, V. D. (2004). "Fish-borne trematodes in Vietnam". The Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 33, 299–301.
48)Olson, P.D., Cribb, T.H., Tkach, V.V., Bray, R.A., Littlewood, D.T.J. (2003). Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda),
International Journal for Parasitology, 33, 733–755.
49)Olson, P. D., Cribb, T. H., Tkach, V. V., Braya, R. A., & Littlewood, D. T. J. (2013). Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda).
International Journal for Parasitology, 33(7), 733-755
50)Omar, M. A., Richard, A. H., Nguyen, V. H. (2004). On The Immature Stages Of
Pallisentis (Pallisentis) Celatus (Acanthocephala: Quadrigyridae) From Occasional Fish Hosts In Vietnam. The Raffles Bulletin Of Zoology, 52(2), 593 – 598.
51)Paiboon - Yutisri & Apirum – Thuhanruksa (1985). Parasites fauna of Oxyeleotris marmoratus (Bleeker) from some natural water resource at Amphoe Pra Nakhon Si Ayutthaya, Thailand”, 122-123.
52)Palmero, C., Costa, L., & Scholz, T. (2015). Molecular phylogeny of Neotropical