IV/ Thử hoạt tính sinh học
I.8/ Tổng hợp các hiđrazit thế
II.8.1/ Điều chế các axit aryloxyaxetic
a/ Phương trình phản ứng
b/ Cách tiến hành
Hòa tan 0,1 mol phenol (meta-crezol hoặc a-naphtol) trong 30ml dung dịch chứa 5,6g KOH. Thêm vào đó 20ml dung dịch của 0,lmol axit monoclo axetic đã đƣợc kiềm hóa bằng 0,05mol K2CO3. Đun hồi lƣu trong 90 phút. Làm nguội hỗn hợp sau phản ứng và axit hóa bằng HC1 (1: 1). Lọc thu lấy sản phẩm axit aryloxyaxetic, rửa bằng nƣớc rồi kết tinh lại bằng etanol - nƣớc.
II.8.2/ Điều chế este etyl aryloxyaxetat
24
b/ Cách tiến hành
Hòa tan 0,1 mol axit aryloxyaxetic trong 25ml etanol, thêm vào đó 3ml H2SO4 đậm đặc rồi đun hồi lƣu trong 6 giờ. cất bới rƣợu dƣ khỏi hỗn hợp phản ứng rồi để nguội, trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 20%. Este tách ra đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc lạnh. Etyl 3- metyl-phenoxyaxetat đƣợc chiết ra ở dạng lỏng, sau đó đƣợc làm khan bằng Na2S04 và chƣng cất thu lấy sản phẩm. Etyl 1-naphtoxyaxetat ở dạng rắn đƣợc lọc sau đó kết tinh lại bằng etanol - nƣớc.
II.8.3/ Điều chếhiđrazit của axỉt aryloxyaxetic
a/ Phương trình phản ứng
ArOCH2COOC2H5+ NH2NH2 ArOCH2CONHNH2 + C2H5OH
b/ Cách tiến hành
Cho 0,05mol este etyl aryloxyaxetat vào bình cầu 100 ml, thêm vào đó l0 ml etanol khan và 1 ml hidrazin hiđrat 50% sau đó tiếp tục thêm dần etanol vào và khuấy để tạo thành dung dịch đồng nhất. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng trong 4 giờ (trong 2 giờ đầu, cứ mỗi giờ lại cho thêm vào hỗn hợp phản ứng lml hiđrazin hiđrat 50%). Sau khi cất loại bới etanol, để nguội hỗn hợp phản ứng sản phẩm tách ra ở dạng rắn. Lọc lấy kết tủa, kết tinh lại một lần bằng bằng etanol - nƣớc và sau đó bằng benzene.
II.8.4/ Phản ứng ngửng tụ giữa hiđrazit vời 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en
a/ Phương trình phản ứng
b/ Cách tiến hành
Cho vào bình cầu 0,02mol 4-axetyl-l-metylxiclohex-l-en trong 30ml toluene, thêm vào đó 0,01mol hidrazit của axit aryloxyaxetic. Đun hồi lƣu hỗn hợp phản ứng trong 2 giờ, sau đó lắp ống tách nƣớc và tiếp tục đun trong 4 giờ nữa. Cất loại bới dung môi toluene rồi để nguội hỗn hợp phản ứng, sản phẩm tách ra ở dạng rắn, Lọc lấy kết tủa, kết tinh lại trong etanol.
III/ Nghiên cứu cấu trúc
Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo bằng phƣơng pháp mao quản trên máy GẠLLENKAMP MPD 350 tại Khoa Hóa Trƣờng ĐHSP Thành phố Hồ Chí Minh.
Phổ hồng ngoại của các chất đƣợc đo trên máy BRUKER-IFS48 tại Trung Tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Thành phố Hồ Chí Minh.
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân của các chất đƣợc đo trên máy BRƢKER Avance 500MHz tại Phòng cấu trúc, Viện Hóa học thuộc Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ Quốc gia, Hà nội.
25
Phân tích sắc ký và khối phổ đƣợc thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia, Hà nội.
IV/ Thử hoạt tính sinh học
Các axít mà chúng tôi tổng hợp đƣợc đều có cấu trúc của một auxin, với những đặc điểm nhƣ: Có cấu trúc vòng đóng vai trò của một nhân auxin; Có ít nhất một liên kết đôi trong vòng; Có mạch nhánh chứa nhóm cácboxyl; Có ít nhất một nguyên tử cacbon ngăn cách giữa nhân và nhóm cacboxyl [25]. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành thăm dò hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của chúng. Hoạt tính điều hòa sinh trƣởng thực vật của các axít (A1) và (A2) đƣợc nghiên cứu trên 2 chỉ tiêu là tỷ lệ nảy mầm của hạt và tốc độ sinh trƣởng của mầm cây. Đối tƣợng đƣợc chọn: đối với thực vật một lá mầm là hạt lúa giống Lg (cho axít A1) và lúa Nàng Thơm (cho axít A2); đối với thực vật hai là mầm là hạt đậu xanh thu hoạch vào vụ mùa 2003. Cách thức tiến hành tƣơng tự nhƣ đã đƣợc mô tả trong tài liệu [8]:
Các công thức thí nghiệm ngâm hạt: nƣớc cất 2 lần (ĐC); axít (A1 và A2) ở các nồng độ l0mg/ lít, 20mg/ lít, 50mg/ lít và l00mg/ lít.
Thời gian ngâm đối với hạt lúa là 48 giờ, đối với hạt đậu là 4 giờ. Kết thúc quá trình ngâm, vớt hạt ra và chọn những hạt tốt, đều nhau xếp vào các hộp Petri có lout giấy lọc đã đƣợc thấm ƣớt đều nhau bằng 5ml nƣớc cất. Mỗi hộp chứa 50 hạt, đƣợc đậy nắp để tránh sự bay hơi của nƣớc, đảm bảo sự giống nhau trong các hộp. Mỗi công thức đƣợc lặp lại 10 lần (10 hộp - đối với hạt lúa) và 6 lần (6 hộp - đối với hạt đậu xanh). Sau khi xếp hạt vào hộp Petri (ủ) 1 ngày thì bắt đầu đếm số hạt nảy mầm. Bắt đầu đo sinh trƣởng của thân và rễ từ ngày thứ 4 (đối với lúa) hay ngày thứ 5 (đối với đậu).
26
PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
I/ Chuyển hóa hóa học I.1/ Tách limonene từ vỏ bƣởi
Limonene thu đƣợc từ tinh dầu vỏ bƣởi bằng cách chƣng cất dƣới áp suất thấp là một chất lỏng trong suốt có mùi cam nhẹ. Phổ hồng ngoại của limonene thu đƣợc từ tinh dầu vỏ bƣởi hoàn toàn trùng với phổ hồng ngoại của D-limonene. Một số vân đặc trƣng trên phổ hồng ngoại của D-limonene là:vCH no= 2920,8cm-1; Vc=c = 1644,7cm-1; vcHanken = 3041,6 và 3083,9cm-1.
Mặc dù có nhiều phƣơng pháp phân tách tinh dầu từ vỏ cam, bƣởi nhƣng chúng tôi lựa chọn biện pháp chƣng cất lôi cuốn hơi nƣớc vì theo nhiều tài liệu [2,4,5], đây là phƣơng pháp tƣơng đối đơn giản, cho tinh dầu có chất lƣợng cao và hiệu suất cũng tốt. Chúng tôi cũng chủ yếu sử dụng vỏ bƣởi để làm nguyên liệu cung cấp tinh dầu do việc thu gom vỏ bƣởi tƣơng đối thuận tiện, hơn nữa việc sơ chế cũng đơn giản và dễ dàng hơn so với vỏ cam.
Trong qua trình phân tách limonene từ vỏ bƣởi, chúng tôi nhận thấy rằng để thu đƣợc tinh dầu với hiệu suất cao và chất lƣợng tốt, vỏ bƣởi cần phải còn tƣơi. Trái lại, nếu sử dụng vỏ bƣởi đã héo hay ủng, không những lƣợng tinh dầu thu đƣợc ít đi mà tinh dầu còn có mùi lạ do vỏ bƣởi dễ bị sậm màu, cháy khét trong qua trình chƣng cất.
I.2/ Tổng hợp 3-(4-metylxicIohex-3-enyl)but-3-en-l-ol
3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol đƣợc tổng hợp trên cơ sở phản ứng giữa limonene và parafocmandehit nhờ xúc tác axit Liuyt. Cơ chế phản ứng nhƣ sau:
Focmandehit đƣợc dùng ở dạng parafocmandehit (HCHO)n nhằm loại trừ sự có mặt của nƣớc trong phản ứng - điều này có thể dẫn đến sự tạo thành sản phẩm không mong muốn do các phân tử nƣớc cũng có thể tham gia phản ứng cộng vào liên kết đôi
27
khi có mặt xúc tác axit. Hơn nữa, nƣớc có thể làm mất hoạt tính của xúc tác SnCl4 do tạo thành các hiđrat kết tinh và tách khỏi môi trƣờng phản ứng.
Ancol tạo thành sau phản ứng đƣợc tách ra khỏi hỗn hợp phản ứng bằng phƣơng pháp chƣng cất dƣới áp suất thấp. Khi đó, chúng tôi thu đƣợc 2 phân đoạn: Phân đoạn 1 có nhiệt độ sôi 92 - 94°c ở áp suất 41mmHg; Phân đoạn 2 có nhiệt độ sôi 145 - 150°c ở áp suất 23mmHg. Các tính chất vật lý của phân đoạn 1 cho thấy chất nhận đƣợc là limonene. Phân đoạn 2 có nhiệt độ sôi cao hơn hẳn, chứng tỏ có chất mới đã đƣợc tạo thành. So sánh phổ hồng ngoại của sản phẩm này với limonene có thể thấy: trên phổ vẫn còn vân hấp thụ ở 1642,7cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết đôi C = C, ngoài ra còn xuất hiện vân tù và rộng ở 3427,7cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết O - H có tham gia liên kết hiđro; vân ở 1131,2cm-1 tƣơng ứng với dao động của liên kết C - O. Nhƣ thế sản phẩm nhận đƣợc là một ancol chƣa no. So sánh nhiệt độ sôi của ancol này và phổ hồng ngoại của nó với các tính chất tƣơng tự của sản phẩm đƣợc công bố trong các tài liệu [4,23] cho phép chúng tôi đánh giá rằng sản phẩm 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol đã đƣợc tạo ra.
I.3/ Phản ứng của 3-(4-metylxiclohex-3-enyI)but-3-en-l-ol với axit monocloaxetic monocloaxetic
Bản chất của phản ứng của 3-(4-metylxiclohex-3-enyl)but-3-en-l-ol với axít monocloaxetic là phản ứng thế nucleophin. Vì thế, để làm tăng khả năng phản ứng của tác nhân acol, cần phải chuyển nó thành dạng ancolat LO-. Việc chuyển hóa này đƣợc thực hiện thông qua phản ứng giữa ancol và natri trong môi trƣờng không có nƣớc. Phản ứng này xảy ra thuận lợi hơn khi dùng huyền phù natri trong toluene nhờ tăng khả năng tiếp xúc tốt giữa natri và ancol.
Khi thêm axit (đã đƣợc cất lại trƣớc khi sử dụng - nhằm loại trừ sự có mặt của nƣớc) vào dung dịch ancolat, sẽ xảy ra phản ứng:
RCOOH + LONa → RCOONa + LOH (L là gốc limonenyl)
vì thế cần phải sử dụng lƣợng dƣ ancolat để đảm bảo sự có mặt của tác nhân ancolat cho phản ứng thế nucleophin:
LONa + ClCH2COONa → LOCH2COONa + NaCl
Sản phẩm nhận đƣợc ở dạng muối, tan tốt trong nƣớc và kém tan trong toluene. Do đó, sau khi kết thúc phản ứng, chúng tôi thêm nƣớc vào hỗn hợp phản ứng và chiết lấy phần dung dịch tan trong nƣớc nhằm loại bỏ ancol dƣ (tan trong toluene). Axít hóa muối để chuyển về dạng axit thì axit lại kém tan trong nƣớc, nhờ thế có thể chiết và tách bỏ đƣợc tạp chất tan trong nƣớc (muối natri monocloaxetat). Lại kiềm hóa và chiết lấy phần dung dịch muối tan trong nƣớc, sau đó axit hóa trở lại và chiết lấy phần hữu cơ bằng ete nhằm thu đƣợc sản phẩm sạch hơn. Cuối cùng, làm khan sản phẩm nhận đƣợc bằng natrisunfat rồi cất loại ete, chúng tôi nhận đƣợc sản phẩm là một chất lỏng rất sánh, màu vàng nâu. Chúng tôi đã tiến hành chƣng cất ở áp suất thấp với mong muốn thu đƣợc sản phẩm axit tinh khiết nhƣng không thành công do sự chuyển hóa (hóa nhựa) của chất trong qua trình chƣng cất. Kết qua phân tích bằng phƣơng pháp GC-MS cho thấy sản phẩm nhận đƣợc là một hỗn hợp của nhiều chất với cấu trúc rất phức tạp và hầu nhƣ chƣa đƣợc xác định (có lẽ đã xảy ra sự chuyển vị của liên kết đôi trong khung menthađien cũng nhƣ sự phá vỡ cấu trúc khung này trong môi trƣờng kiềm mạnh ở nhiệt độ cao), trong đó thành phần chính (chiếm
28
khoảng 33%) có khối lƣợng phân tử giống nhƣ khối lƣợng phân tử của axit A1 mà chúng tôi dự kiến tổng hợp.
I.4/ Phản ứng của muối và etylbromua trên chất mang Silicagel:
Thông thƣờng, ngƣời ta thực hiện phản ứng este hóa một cách đơn giản nhờ phản ứng giữa axit và ancol với sự có mặt của H2SO4 đặc làm xúc tác. Tuy nhiên, trong trƣờng hợp cụ thể, axit limonenoxyaxetic có những liên kết đôi trong phân tử, mà những liên kết đôi này rất dễ tham gia vào phản ứng cộng nƣớc khi có mặt axít. Với mong muốn tổng hợp este của axit limonenoxyaxetic, chúng tôi chọn biện pháp an toàn hơn là dùng phản ứng giữa muối của axit này với etyl bromua trên chất mang silicagel. Bản chất của phản ứng này cũng là phản ứng thế nucleophin mà lon cacboxylat là tác nhân tấn công. Khi đó, nồng độ lon này càng cao, phản ứng xảy ra càng thuận lợi. Chúng tôi lựa chọn muối kali limonenoxyaxetat cho phản ứng này. Nguyên nhân là do lon kali có bán kính lớn hơn so với lon natri nên cặp lon LOCH2COO-K+ lỏng lẻo, thuận lợi cho sự hình thành tác nhân tấn công - lon cacboxylat tự do. Chất mang silicagel vừa tạo điều kiện cho tác nhân và chất phản ứng tiếp xúc với nhau tốt hơn, vừa hoạt hóa tác nhân (làm liên kết LOCH2COO"M+ trở nên lỏng lẻo hơn) nhờ cấu trúc silosan và silanol của chúng [9]:
Chiết hỗn hợp phản ứng bằng ete, sau đó cất loại ete rồi cất dƣới áp suất thấp, chúng tôi thu đƣợc sản phẩm không màu, có mùi thơm dễ chịu. Điều này cho phép chúng tôi nghĩ rằng sản phẩm este đã đƣợc tạo ra. Phổ hồng ngoại của sản phẩm này cũng xác nhận điều đó. Trên phổ có thể thấy rõ vân hấp thụ với cƣờng độ mạnh ỏ 1755,4cm"1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm C=O; vân hấp thụ ở 1641,4cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết đôi C=C ... và không thấy vân hấp thụ ở vùng trên 3000 cm-1 ứng với dao động hóa trị của nhóm OH. Mặc dù vậy, kết qua phân tích bằng GC-MS cho thấy đây là một hỗn hợp sản phẩm, cấu trúc của các chất phần lớn chƣa đƣợc xác định, trong đó thành phần chính có thể có công thức nhƣ dự kiến. Có lẽ trong qua trình phản ứng tạo thành axit limonenoxyaxetic từ ancol trong môi trƣờng kiềm mạnh, cũng nhƣ trong qua trình chuyển hóa axit thành este với sự có mặt của chất mang silicagel đã tạo điều kiện cho các phản ứng chuyển vị của liên kết đôi và các phản ứng phá vỡ cấu trúc khung menthadien xảy ra. Chúng tôi chƣa phân tách đƣợc sản phẩm este ở dạng tinh khiết.
I.5/ Tổng hợp dẫn xuất 9-triclometyllimonene
Chúng tôi tiến hành tổng hợp 9-triclometyllimonene dựa trên quy trình tổng hợp của các tác giả [10]. Theo các tác giả này, phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn; giai đoạn đầu là phản ứng cộng của cacbontetraclorua vào liên kết đôi ngoài vòng của limonene để tạo thành 8-clo- 9-triclometyllimonene. Phản ứng này xảy ra theo cơ chế gốc với sự có mặt của chất khơi mào benzoylperoxit. Do phản ứng đƣợc thực hiện trong thời gian tƣơng đối dài (24 giờ), nên chất khơi mào đƣợc thêm vào nhiều lần để
29
đảm bảo hiệu lực của nó. Giai đoạn 2 xảy ra khi chƣng cất thu sản phẩm ở nhiệt độ cao, đó là phản ứng tách loại hiđroclorua để tạo thành 9-triclometyllimonene. Cấu trúc của sản phẩm đã đƣợc các tác giả xác nhận. Chúng tôi cũng đã thu đƣợc sản phẩm có nhiệt độ sôi phù hợp với nhiệt độ sôi của sản phẩm đƣợc các tác giả công bố.
I.6/ Thủy phân dẫn xuất 9-triclometyllimonene
Theo kết qủa công bố trong tài liệu [1 1], khi thủy phân 9-triclometyllimonene trong kalihiđroxit - etanol trong ống hàn kín ở nhiệt độ cao, sản phẩm nhận đƣợc là muối kali 3-(4- metylxiclohex-3-enyl)but-2-enoat. Axit hóa muối này bằng axit clo hiđric sẽ cho axit limonenecacboxylic tƣơng ứng với nhiệt độ nóng chảy 94,5°C. Theo các tác giả [11], 9- triclometyllimonene không bị thủy phân trong KOH - C2H5OH ở nhiệt độ thƣờng, nhƣng bị thủy phân trong dung dịch kalihiđroxit - etylen glycol đun sôi ở 180°C. Axít hóa sản phẩm tạo thành cũng nhận đƣợc axít limonenecacboxylat. Tuy nhiên, theo các tác giả này, axít lại có nhiệt độ nóng chảy 109,6°c. Trong cả 2 công trình trên, các tác giả đều không thấy công bố các dữ liệu chứng minh cho cấu trúc của sản phẩm axít nhận đƣợc. Vì thế. chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu cấu trúc của sản phẩm nhận đƣợc sau khi xử lý 9-triclometyllimonene trong dung dịch kalihiđroxit - etylen glycol (có nhiệt độ nóng chảy 108 - 109°C) nhằm xác định cấu trúc chắc chắn của chất này.
Phổ hồng ngoại của sản phẩm nhận đƣợc cho thấy đây có thể là một axit không no với các vân hấp thụ rộng và tù ở 2500 - 3250cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị của nhóm OH (tự do hay liên kết hidro), vân có cƣờng độ mạnh ở 1687,2cm-1đặc trƣng cho dao động hóa trị C=O; vân ở 1631,5 cm-1 đặc trƣng cho dao động hóa trị C=C....
Khối phổ của chất này cho thấy khối lƣợng phân tử của chất là 180đvC (M* = 180); chất này là một axit do có vạch đặc trƣng 135 = M+ - 45. Vạch 119 = M+ - 45 -16 cho thấy axit vẫn còn có nhóm CH3 ở bên ngoài vòng xiclohexen (cấu trúc của vòng xiclohexen có thể thấy qua vạch đặc trƣng C5H7+= 67).
Phân tích phổ cộng hƣởng từ proton của axít này có thể thấy: Hai proton liên kết với cacbon sp2 đều cho tín hiệu cộng hƣởng ở vùng trung bình và có cƣờng độ tích phân bằng 1. Tuy nhiên, proton ở ngoài vòng xiclohexen sẽ cho tín hiệu singlet ở trƣờng yếu hơn vì nó liên kết với nguyên tử cacbon ở cạnh nhóm -COOH hút electron mạnh, đồng thời proton này cũng