Để kiểm tra độ tinh khiết vă xâc định cấu trúc hoâ học những chất mă chúng tôi đê tổng hợp được, chúng tôi tiến hănh đo nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, đo phổ hồng ngoại vă tử ngoại.
2.2.4.1. Tính chất vật lý.
* Trạng thâi:
Câc dẫn chất của hydrazon, oxim, semicarbazon, thiosemcarbazon đa số ở dạng bột, hầu như không tan trong nước, cloroform. ít tan trong methanol vă ethanol ở điều kiện thường, nhưng tan tốt trong dung môi nóng. Còn đối với câc dung môi như aceton, DMF thì đa số câc chất tổng hợp được tan tốt ở ngay nhiệt độ thường.
* Nhiệt độ nóng chảy của câc chất tổng hợp được xâc định bằng mây đo nhiệt độ nóng chảy Gallenkamp. Kết quả ghi ở bảng 2.
2J.4.2. Sắc ký lớp mỏng (SKLM).
Để kiểm tra độ tinh khiết của câc chất tổng hợp vă xâc định thời gian phản ứng tối ưu. Chúng tôi đê tiến hănh lăm sắc ký lófp mỏng trín bản mỏng Kieselgel 60 1^254 (Merck). Dung môi hoă tan lă ethanol với 3 hệ dung môi triển khai khâc nhau vă phât hiện vết sắc ký bằng soi đỉn tử ngoại Vilber Lourmat ỏ bước sóng 254 nm. Đê xâc định được Rf đặc trưng cho từng chất ( kết quả ghi ở bảng 2).
2.2.4.3. Xâc định cấu trúc.
* Phđn tích phổ hồng ngoại.
8 chất ( I,II,III,IV,V,VI,VII,VIII) tổng hợp được đê ghi phổ hồng ngoại trín mây Perkin Elmer tại phòng thí nghiệm trung tđm (Trưòỉng Đại Học Dược Hă Nội). Vùng phổ ghi được 4000 -500 cm ‘.
Biín giải phổ hổng ngoai: Câc chất chúng tôi tổng hợp được có hăng loạt câc nhóm chức có câc liín kết;^ = 0 , = N -H ,-0 -H , ^C=N- , ^ c = c c ...
Xĩt câc dải hấp thụ trín phổ đổ có thể nhận thấy câc dải hấp thụ đặc trưng của câc nhóm chức vă liín kết của câc chất tổng hợp được.
* Phđn tích phổ tử ngoại.
8 chất tổng hợp được đê được ghi phổ tử ngoại trín mây Cary lE-Visible Spectro photometer varían tại phong thí nghiệm trung tđm (Trường Đại Học Dược Hă Nội). (Kết quả ghi ỏ bảng 3. 8 phổ đồ xem phần phụ lục)
* Nhân xĩt quâ trình tổns hơv hoâ hoc
- Từ thioure vă acid monocloro acetic, chúng tôi đê tổng hợp được chất trung gian thiazolidin-2,4- dion vă ngưng tụ hợp chất năy với vanilin để được chất trung gian thứ 2 lă vanilyliden thiazolidin-2,4-dion.
- Ngưng tụ vanilyliden thiazolidin-2,4-dion với câc chất hydroxylamin,
Phenylhydrazin, isonicotinoyhydrazin, 2,4-dinitro Phenylhydrazin, semicarbazid,
thiosemicarbazid... vă thu được 6 chất tương ứng đều lă những chất kết tinh. Hiệu suất của câc phản ứng đạt từ 39% đến 66,7%.
- Đê xâc định độ hoă tan của câc chất tổng hợp được trong 1 số dung môi hữu cơ khâc nhau. Kiểm tra độ tinh khiết bằng nhiệt độ nóng chảy vă sắc ký lớp mỏng.
- Sơ bộ xâc định cấu trúc bằng quang phổ hồng ngoại vă tử ngoại ( Bảng3) Câc kết quả thu được cho phĩp chúng tôi kết luận rằng, cả 8 chất chúng tôi tổng hợp được đều đúng với công thức dự kiến.
2.3.Thử tâc dụng sinh học.
Với hy vọng tìm được những dẫn chất mới thuộc dêy dẫn chất vanilyliden thiazolidin-2,4-dion có tâc dụng khâng khuẩn vă khâng nấm. Chúng tôi đê đem những chất tổng hợp được tiến hănh thử tâc dụng khâng nấm-khâng khuẩn tại Bộ môn Vi Sinh (Trường Đại Học Dược Hă Nội).
Để thử tâc dụng khâng khuẩn vă khâng nấm của câc chất đê tổng hợp, chúng tôi sử dụng phuofng phâp khuyếch tân trín thạch với câc khoanh giấy lọc đê tẩm chất thử (Dược điển Việt Nam III-[1]).
Hoạt tính khâng khuẩn vă khâng nấm được đânh giâ bằng khả năng ức chế sự phât triển của vi sinh vật kiểm định, tạo thănh vòng vô khuẩn có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ chất thử.
- Chuẩn bị mẫu thử.
Câc mẫu thử (gồm 8 chất:I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII) được pha ở nồng độ3 mg/ml trong dung môi thích hợp (DMF), rồi tẩm văo câc khoanh giấy (đường kính 7mm, đê tiệt trùng). Với mỗi khoanh giấy lọc đê tẩm chất thử chứa khoảng 30 |J. g chất thử.
-Vi sinh vật kiểm định.
Chúng tôi thử tâc dụng sinh học trín 10 loại vi sinh vật.
Câc chủng vi sinh vật dùng trong nghiín cứu lă những chủng quốc tế vă một số chủng được phđn lập ỏ Việt Nam.
10 chủng vi sinh vật đó bao gồm : 4 chủng vi khuẩn Gr(+), 5 chủng vi khuẩn Gr(-) vă một chủng nấm.
4 chủng vi khuẩn Gr(+) lă:
Bacillus pumilus NCTC 8241 Bacillus cereus ATCC9946 Staphylococcus aureus ATCC 12228 Sarcina lutea ATCC 9341
5 chủng vi khuẩn Gr(-) lă:
Escherichia coli ATCC 25922 Salmonella typhy DT 220 Proteus mirabilis BV 108 Shigella Aexneri DT 112 Pseudomonas aeruginosa VM 201
1 chủng vi nấm lă
Candida albicans ATCC 10231.
Câc chủng vi sinh vật trước khi thử được cấy văo câc mồi trường dinh dưỡng thích hợp. Sau 18 đến 24 giờ nuôi cấy được lăm thănh câc nhũ dịch vi sinh vật có nồng độ khoảng 10^ đến 10^ tế băo/ml trong NaCl 0,9% để tạo ra được vùng ức chế có ranh giới rõ răng.
- Môi trường chúng tôi sử dụng.
Gồm 3 môi trường lă: Môi trường thạch nền ( môi trưòfng 1) Môi trường cao thịt-cao men ( môi trường 2) Môi trường Sabouraud ( môi trường 3)
Sau khi đê chuẩn bị mẫu thử, vi sinh vật, môi trường. Chúng tôi tiến hănh thử trín câc hộp petri có đưòfng kính bằng nhau, đổ khoảng 10-Ỉ2ml môi trường 1 để tạo mặt phẳng, sau đó thím 8 ml môi trường 2 (nếu thử vi khuẩn) hoặc 8 ml môi trường 3 (nếu thử vi nấm) có trộn nhũ dịch vi sinh vật kiểm định với nồng độ 1 % so với môi trường lín bề mặt môi trường 1. Khi thạch nguội đặt khoanh giấy đê tẩm chất thử lín bề mặt thạch theo một sơ đồ đê quy định. Để ỏ nhiệt độ phòng trong 2 giờ cho câc chất thử khuyếch tân văo môi trường. Kết quả được đọc sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 35°c đến 2>TC (đối vód vi khuẩn) vă 25°c đến 28‘^c (đối vófi vi nấm), đo đưòfng kính vòng vô khuẩn bằng thước chính xâc đến
Kết quả ghi ở bảng 4.
Dưới đăy lă hình ảnh minh hoạ về tâc dụng khâng khuẩn - khâng nấm của câc chất tổng hợp được.
Vòng vô khuẩn của câc chất I, II, III, IV với chủng Staphylococcus c ureus ATCC 12228 ở nồng độ 3mg/ml.
Vòng vô khuẩn của câc chất V, VI, VII, VIII với chủng Proteus mirabilis BV108 ở nồng độ 3mg/ml
Vòng vô khuẩn của câc chất V, VI, VII, VIII với chủng nấm Candida albicans ở
Nhận xĩt:
8 chất tổng hợp được đê đem thử tâc dụng sinh học trín 10 chủng vi sinh vật (trong đó có 9 chủng vi khuẩn vă 1 chủng vi nđm) chúng tôi thu được kết quả như sau:
- Với thiazolidin-2,4-dion ( chất I) không có tâc dụng với cả 10 chủng vi sinh vật đem thử. Nhưng khi gắn vanilin văo vị trí số 5 của thiazolidin-2,4-dion sản phẩm thu được lă vanilyliden thiazolidin-2,4-dion lại có tâc dụng với một số chủng Gr(+) đem thử như: Bacillus pumilus, Staphylococcus aureus.
- Câc dẫn chất oxim, phenylhydrazon, isonicotinoyhydrazon, 2,4-dinitro phenylhydrazon, semicarbazon, thiosemicarbazon (Câc chất III, IV, V, VI, VII, VIII) đều có tâc dụng trín câc chủng vi sinh vật thử ở mức độ khâc nhau.
Câc chất (III, IV, VII, VIIĨ) tâc dụng trín cả 4 chủng vi khuẩn Gr(+) đem thử, 1 chủng vi khuẩn Gr(-) lă Proteus mirabilis, chất VI có tâc dụng trín 3 chủng vi khuẩn Gr(+), 1 chủng vi khuẩn Gr(-) vă cả 5 chất trín đều có tâc dụng với nấm Candida albicans đem thử.