PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng
Đề tài được tiến hành trên giống huệ hương, đây là giống huệ quý được lưu giữ tại Trung tâm Ứng dụng tiến bộ khoa học và công nghệ thuộc sở Khoa học và Công nghệ Bình Định.
Vật liệu dùng để nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ, có kích thước 1-2mm.
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2008 đến 08/2009.
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Giai đoạn khử trùng mẫu: Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa huệ.
Để tìm ra được hóa chất và phương pháp khử trùng có hiệu quả cao nhất, tiến hành các thí nghiệm sau:
Thí nghiệm 1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 2mg/l BA
Công thức Thời gian khử trùng (phút)
CT1( Đ/C) 7 CT 2 10 CT 3 12 CT 4 15 CT 5 17 CT 6 20
Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar + 2mg/l BA
Công thức HgCl2 0,1% (phút) Ca(OCl)2 15% (phút) CT1 15 0 CT 2 15 10 CT 3 15 20 CT 4 15 30 CT 5 15 40
Ghi chú: 15 phút khử trùng HgCl2 0,1% là công thức tốt nhất của thí nghiệm 1
3.2.2. Giai đoạn nuôi cấy khởi động
Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng trên nền môi trường đặc (có 6,5g/l agar) bổ sung 30 g/l saccaroza tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy.
Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT 2 1 CT 3 2 CT 4 3 CT 5 4 CT 6 5
Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Công thức Nồng độ BA (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT 2 1 CT 3 2 CT 4 3 CT 5 4 CT 6 5
Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) CT1 4 0 CT 2 4 0,25 α-NAA CT 3 4 0,25 IAA CT 4 4 0,25 IBA CT 5 4 0,25 2,4D
Ghi chú: 4mg/l BA là công thức tốt nhất của thí nghiệm 2
3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh
3.2.3.1. Nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l) CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25
Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l)
CT1 0,0 0,25
CT 2 0,5 0,25
CT 3 1,0 0,25
CT 5 2,0 0,25
CT 6 2,5 0,25
CT 7 3,0 0,25
Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l)
CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25
Thí nghiệm 9. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ kinetin (mg/l) Nồng độ IAA (mg/l)
CT1 0,0 0,25 CT 2 0,5 0,25 CT 3 1,0 0,25 CT 4 1,5 0,25 CT 5 2,0 0,25 CT 6 2,5 0,25 CT 7 3,0 0,25
Thí nghiệm 10. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển của chồi.
Thí nghiệm bố trí trên nền môi trường nhân nhanh tốt nhất được rút ra từ các thí nghiệm trên.
Công thức Hàm lượng nước dừa (ml/l)
CT1(Đ/C) 0
CT 2 50
CT 3 100
CT 4 150
CT 5 200
3.2.3.2. Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy protocorm trong nhân nhanh
nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ BA (mg/l) CT1(Đ/C) 0 CT 2 1 CT 3 2 CT 4 3 CT 5 4 CT 6 5
Thí nghiệm 12. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy protocorm.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ α-NAA (mg/l) CT1 3 0,00 CT 2 3 0,25 CT 3 3 0,50 CT 4 3 0,75 CT 5 3 1,00 CT6 3 1,25
Ghi chú: 3mg/l BA là công thức tốt nhất ở thí nghiệm 12
3.2.4. Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
Thí nghiệm 13. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức Than hoạt tính (g/l)
CT1(Đ/C) 0,0
CT 2 0,5
CT 3 1,0
CT 4 1,5
CT 5 2,0
Thí nghiệm 14. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng ra rễ và chất lượng rễ.
Môi trường nền: MS + 30g/l saccaroza + 6,5g/l agar
Công thức α-NAA (mg/l)
CT 2 0,25
CT 3 0,50
CT 4 0,75
CT 5 1,00
CT 6 1,50
3.2.5. Giai đoạn vườn ươm
Thí nghiệm 15. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống và sinh trưởng, phát triển của cây.
Công thức Giá thể
CT1(Đ/C) Xơ dừa
CT2 Đất + Xơ dừa (1:1)
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng công nghệ sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoa học công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định.
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 30- 50 bình, mỗi bình cấy 1-3 mẫu tùy từng thí nghiệm.
Thí nghiệm ngoài vườn ươm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây.
* Môi trường nuôi cấy:
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962).
Môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng, than hoạt tính với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm.
Giá trị pH của môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,8-6,0. Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 1210C, áp suất 1,1 atm trong 25 phút.
* Điều kiện nuôi cấy:
Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao, kéo, banh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn.
Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20-30 phút. Nhiệt độ phòng nuôi: 250C ± 2
Cường độ ánh sáng: 2000 lux Độ ẩm 70%.
Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/10h tối.
3.3.2. Phương pháp tiến hành
* Phương pháp khử trùng mẫu cấy
Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ huệ. Các củ huệ có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch bề mặt mẫu vật bằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi có bám đất cát. Củ huệ được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Sau đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắt ngủ. Sau đó rửa lại bằng nước
cất và đem vào buồng cấy để khử trùng.
Khử trùng mẫu trong buồng cấy bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi rửa lại bằng cồn 70% trong 15-20 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 lần. Sau đó tiến hành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm để tìm ra chế độ khử trùng tốt nhất.
* Phương pháp nuôi cấy khởi động:
Các mẫu sau khi khử trùng được cắt bằng dao chỉ lấy phần đỉnh mắt ngủ có kích thước từ 1-2mm. Sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tùy từng thí nghiệm.
* Phương pháp nhân nhanh:
Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2-3cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng.
Các protocorm hình thành trong quá trình nuôi cấy khởi động mẫu và nhân nhanh chồi được tách ra rồi cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng.
* Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh:
Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4-5cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính.
* Phương pháp ươm cây:
Các cây huệ hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau. Theo dõi các tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây.
3.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi
* Giai đoạn khử trùng mẫu
∑ số mẫu sạch
- Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100 ∑ số mẫu đưa vào
∑ số mẫu nhiễm
- Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 ∑ số mẫu đưa vào
∑ số mẫu sạch sống
- Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 ∑ số mẫu đưa vào
∑ số mẫu sạch chết
- Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 ∑ số mẫu đưa vào
* Giai đoạn nuôi cấy khởi động
∑ số mẫu PSHT
- Tỷ lệ mẫu PSHT (%) = x 100 ∑ số mẫu nuôi cấy
∑ số mẫu tạo chồi + protocorm
- Tỷ lệ tạo chồi + protocorm (%) = x 100 ∑ số mẫu nuôi cấy
∑ số mẫu tạo protocorm
- Tỷ lệ tạo protocorm (%) = x 100 ∑ số mẫu nuôi cấy
* Giai đoạn nhân nhanh :
∑ số chồi tạo thành - Hệ số nhân (lần) =
∑ số chồi nuôi cấy ban đầu
∑ số chồi tạo thành - Hệ số nhân (chồi/protocorm) =
∑ số protocorm nuôi cấy ban đầu
∑ chiều cao các chồi theo dõi - Chiều cao TB của chồi (cm) =
∑ lá của các chồi theo dõi - Số lá TB của chồi (lá/chồi) =
∑ số chồi theo dõi
* Giai đoạn ra rễ :
∑ số chồi ra rễ
- Tỷ lệ ra rễ (%) = x 100
∑ số chồi nuôi cấy
∑ số rễ của các chồi theo dõi - Số rễ TB/chồi (rễ) =
∑ số chồi theo dõi
∑ chiều dài của các rễ theo dõi - Độ dài TB của rễ (cm) =
∑ số rễ theo dõi
* Giai đoạn đưa cây in vitro ra vườn ươm
Để đánh giá kết quả của công đoạn này chúng tôi theo dõi các chỉ tiêu sau:
∑ số cây sống
- Tỉ lệ cây sống (%) = x 100
∑ số cây đưa ra giá thể
∑ chiều cao các cây theo dõi - Chiều cao TB của cây (cm) =
∑ số cây theo dõi ∑ số lá của các cây theo dõi
- Số lá TB (lá/cây) =
∑ số cây theo dõi
3.4. Xử lý số liệu
Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel và phần mềm IRRISTAT 4.0 (Phạm Tiến Dũng, 2003).
Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least Significant Different ở độ tin cậy 95%).