2.2.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính. Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Nhóm hợp chất Phản ứng Thuốc
thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng.
Diazo
hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính. Dung
dịch kiềm
NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam.
Acid sulfuric
H2SO4
10%
Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin.
Tannin
Vanilin/H2SO4 Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện. Alkaloid Bouchar dat Hỗn hợp KI + I2 /HCl
Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm.
VansMa yer
Hỗn hợp HgCl2+ KI
Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt.
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphen- ol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng.
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong
mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm có màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ= 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic.
Các bước tiến hành như sau:
Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất:
Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic:
Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100μl ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 μl mẫu thử (dung dịch acid gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58 ml H2O + 100 μl thuốc thử Folin-Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 μl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 μl (0,02 ml)
để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột béo phì thực nghiệm.
2.2.3.1. Thử độc tính cấp, xác định LD50
Xác định LD50 của dịch chiết quả Bí đao bằng đường uống theo phương pháp Lorke [12]. Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N= 10 và cho uống theo liều tăng dần lên đến 8 g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.).
2.2.3.2. Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về được chăm sóc ở điều kiện bình thường trong 3- 4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành hai nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:
Nhóm 1- Nhóm đối chứng: các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng
Nhóm 2- Nhóm nuôi béo: các con chuột được chăm sóc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dưỡng.
Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 8 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu. Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lí thống kê.
2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)
Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết quả Bí đao lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [14].
2.2.4.1. Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2
Để có mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 8 tuần, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (110 mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH= 4,3).
Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ (sau khi tiêm STZ). Đo 3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy giá trị trung bình.Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định được lựa chọn để cho uống cao phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày. Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12 giờ), chỉ cho uống nước.
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịchchiết
Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết như bảng 2.2. Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày
và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, thứ 10, thứ 15, thứ 21 khi điều trị.
Bảng 2.2. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao (Benincasa hispida Cogn.)
Lô Chế độ ăn
trước điều trị Tiêm Mục đích
1 Thức ăn
chuẩn Uống nước cất, không điều trị.
2 Thức ăn béo STZ Uống nước cất, không điều trị.
3 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethanol (2000mg/kg). 4 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn n- hexan (2000mg/kg). 5 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn CHCl3 (2000mg/kg). 6 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate
(2000mg/kg).
7 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn nước (2000mg/kg). 8 Thức ăn béo STZ Điều trị metformin (500mg/kg) thể trọng.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả tách chiết các phân đoạn từ quả Bí đao
Để tìm hiểu thành phần hóa học của quả Bí đao, chúng tôi tiến hành chiết theo đúng quy trình. Phân bố đều cao ethanol trong nước cất, sau đó chiết phân lớp lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, chloroform và ethylacetate. Kết quả được trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1.
Loại dung mmôi 46,5g CPĐ n -hexan Phần còn lại (bã) 42,7g CPĐ ethylacetate 57,4g CPĐ nước 20,31g CPĐ chloroform Phần còn lại (bã) Loại dung môi
Loại dung môi Để lại 20% là (50g) khối lượng cao ethanol tổng số Bổ sung ethylacetate Bổ sung chloroform Bổ sung nước, n –hexan 250g Cao ethanol tổng số 3000g quả Bí đao Chiết ethanol 3 lần
Hình 3.1. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ quả Bí đao
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi thu được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3000 gam bột mịn quả Bí đao như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ quả Bí đao
Phân đoạn Mẫu ban
đầu (g)
Khối khô tuyệt đối (g)
Hiệu suất chiết rút
(% nguyên liệu khô)*
Cao ethanol 250 30 15
Cao n – hexan 46.5 2.3 4.94
Cao ethylacetate 42.7 1.46 3.42
Cao pđ nước 57.4 1.8 3.14
(* Tính theo nguyên liệu khô ban đầu)
Từ hình 3.1 và bảng 3.1 ta thấy hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (15%) so với khối lượng nguyên liệu khô ban đầu là 50g, tiếp đến là cao phân đoạn n-hexan (4,94%), cao phân đoạn ethylacetate (3,42%), cao phân đoạn nước (3,14%) và thấp nhất là cao phân đoạn chloroform (2,81%). Kết quả này cho thấy trong quả Bí đao rất phong phú về các hợp chất tự nhiên.
3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết quả Bí đao, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng như sau.
3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong quả Bí đao
Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi thu được kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu Cao ethanol Phân đoạn n- hexan Phân đoạn chloroform Phân đoạn ethylacetat Nước Flavonoid Shinoda ++ + + ++ + Diazo + + - + - H2SO4 đặc + + + ++ -
Catechin Vanilin/HCl (đ) + + + ++ - Tannin Vanilin + + + ++ + Gelatin/NaCl ++ + + ++ + Acetat chì ++ + + +++ + Polyphenol khác NaOH 10% ++ + + +++ ++ FeCl3 5% +++ ++ +++ +++ + Glycoside Keller-killian ++ ++ + ++ ++ Alkaloid Mayer + - - + - Dragendroff ++ + + ++ + Bouchardat + - - + - Sponin Tạo bọt + + + ++ +
(Ghi chú: (+): các mức phản ứng dương tính; (-): phản ứng âm tính; mức độ phản ứng được thể hiện bằng số dấu cộng)
Kết quả định tính cho thấy thành phần các hợp chất trong quả Bí đao khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như: flavonoid, tannin, alkaloid và glycoside. Trong đó, ở các phân đoạn cao ethanol, EtOAc và phân đoạn cao cồn tổng số hầu hết phản ứng với các nhóm chất đều là dương tính; phân đoạn cao chloroform có chứa tương đối đầy đủ các chất trừ các phản ứng Diazo, Mayer, Bouchardat- trong đó các chất thấy có hàm lượng cao là polyphenol, glycoside; các chất còn lại có nhưng có hàm lượng thấp. Trong phân đoạn nước chứa nhiều các chất như polyphenol, glycoside, không thấy xuất hiện catechin cũng như phản ứng với Diazo và Bouchardat. Từ bảng 3.2. ta thấy ở phân đoạn cao cồn tổng số và phân đoạn cao ethylacetate chứa rất nhiều polyphenol chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư. Kết
quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục những nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin-Ciocalteau.
3.2.2.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Đường chuẩn acid gallic được xây dựng bằng cách chuẩn bị các dung dịch acid gallic ở các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l, tiến hành trên máy ERMA ở bước sóng 765nm. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2.
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519 y = 0.001x + 0.0128 R2 = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 axit gallic (m g/L) O D 7 6 5 n m
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn acid gallic
3.2.2.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Bảng 3.4. Định lượng polyphenol tổng số các phân đoạn dịch chiết
Mẫu OD765nm Hàm lượng Polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.387 874.2 8.742 Cao n-hexan 0.237 224.2 2.242 Cao EtOAc 0.783 314.6 3.146 Cao CHCl3 0.245 232.2 2.322 Cao nước 0.116 103.2 1.032
Từ bảng định lượng 3.4 ta nhận thấy hàm lượng polyphenol tổng số trong cao phân đoạn EtOH là cao nhất (8,742%), sau đó đến phân đoạn cao EtOAc (3,146%); trong khi đó phân đoạn n-hexan và chloroform có hàm lượng polyphenol tổng số gần tương đương nhau (chiếm 2,242% và 2,322% tương ứng). Đối với phân đoạn nước hàm lượng polyphenol tổng số thấp nhất (1,032%).
Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong quả Bí đao có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao ethanol và cao ethylacetate. Điều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi không phân cực và ít tan trong dung môi phân cực. Chính vì polyphenol là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao nên chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n- hexan, chloroform, cao phân đoạn nước vào điều trị cho chuột gây béo phì và ĐTĐ.
3.3. Kết quả xác định liều độc cấp
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ quả Bí đao trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [12]. Chuột cho nhịn đói
trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 5 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết quả Bí đao.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đường uống.
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. Đến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ quả Bí đao hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao theo đường uống.
3.4. Kết quả mô hình chuột béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 - 17g) được chia làm 8 lô.
Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lô 2 - 8: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Sau 8 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân trọng lượng chuột. Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.6 và hình 3.3.
Bảng 3.6. Trọng lượng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng khác nhau
chuột đầu tại các thời điểm khác nhau (g) Tu ần 1 Tu ần 2 Tu ần 3 Tu ần 4 Tu ần 5 Tu ần 6 Tu ần 7 Tu ần 8 Nhóm ăn thường 15.54 20.01 24.59 26.86 28.63 31.90 35.18 38.45 40.22 ±1.05 ±0.77 ±0.66 ±0.57 ±0.59 ±0.72 ±0.92 ±1.14 ±1.38 Nhóm ăn béo 15.26 21.51 29.47 36.92 41.88 47.34 52.30 56.25 62.81 ±1.15 ±1.29 ±1.56 ±1.81 ±2.07 ±2,15 ±2.37 ±2.49 ±2.90 (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*)
(Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của các lô chuột; (*): p < 0.05 so sánh với nhóm ăn thường)
Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 8 tuần.
Bảng 3.6 và hình 3.3 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về trọng lượng lớn
15.54 15.26 20.0121.51 24.59 29.47 26.86 36.92 28.63 41.88 31.90 47.34 35.18 52.30 38.45 56.25 40.22 62.81 0 10 20 30 40 50 60 70 Trọng lượng chuột (g)
Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8
hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể là:
Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về trọng lượng không có ý ngĩa thống kê (p> 0.05).
Sau 8 tuần nuôi, chuột nuôi với thức ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thêm 24,68 gam ứng với 158,82% so với ban đầu, trong khi chuột nuôi