V. VẬT LIỆU SINH HỌC TẠO KHUNG (SCAFFOLD) TRONG KỸ NGHỆ MƠ
V.9.2. Lớp apatite với protein huyết thanh làm scaffold cho sự tăng trưởng của nguyên bào xương
nguyên bào xương
Mặc dù phương pháp ghép tự thân được xem là tốt nhất để điều trị khiếm khuyết xương nhưng phương pháp này vẫn cĩ nhiều khuyết điểm như hạn chế mơ ghép, phải phẫu thuật nhiều…. Trong những năm gần đây, số lượng các trường hợp ghép xương nhân tạo tăng lên và các mơ được nuơi cấy exvivo đã gây được sự chú ý. Vì vậy, các thiết bị nuơi cấy mơ nhân tạo càng trở nên quan trọng hơn. Tế bào mầm phơi, tế bào mầm trung mơ và tế bào mầm từ tủy xương cĩ thể được sử dụng để tạo ra mơ xương vì các tế bào này biệt hĩa thành tế bào xương. Lớp apatite lắng trên hydroxyapatite khơng ức chế sự tăng trưởng của tế bào trong nuơi cấy. Lớp apatite này được xử lý theo quy trình “bắt chước” sinh học, cơ bản dựa
trên biến đổi bề mặt và tiếp theo là ngâm trong dịch cơ thể. Vật liệu thu nhận được giống với mơ tự nhiên hơn là vật liệu tổng hợp.
Quy trình cụ thể: Hydroxyapatite (HA) gốm và titanium biến đổi bề mặt được sử dụng làm cơ chất của các lớp apatite. Chuẩn bị HA gốm từ bột HA được tổng hợp bởi phản ứng kết tủa Ca(NO3)2và (NH4)2HPO4. Chuẩn bị titanium biến đổi bề mặt bằng cách xử lý trong dung dịch NaOH 10N và nhiệt độ 6000C. Mơi trường nuơi cấy cĩ bổ sung 10% huyết thanh bị cĩ thai (FBS – Fetal bovine serum) được rĩt vào đĩa 24 giếng cĩ cơ chất để tạo thành các lớp apatite. Các lớp này được chia thành lớp apatite cĩ protein huyết thanh và lớp apatite khơng cĩ protein huyết thanh. Sau khi ngâm 7 ngày, các lớp hình thành trên tiêu bản được đánh giá bằng nhiễu xạ tia X lớp mỏng (Thin film X-ray diffraction – TF-XRD), kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy - SEM) và phổ kế phát tán năng lượng (Energy dispersive spectromethory - EDS). Các nguyên bào xương (MC3T3-E1), nguyên bào sợi (L929) và tế bào thần kinh (SK-N-SH) được sử dụng để đánh giá khả năng tương hợp tế bào của các lớp tạo thành. Mỗi lọai tế bào được nuơi trong đĩa 24 giếng với các mẫu riêng biệt. Đếm số tế bào bám sau 3 ngày nuơi cấy bằng phịng đếm hồng cầu và sau đĩ tính tĩan tỷ lệ tăng sinh. Quan sát hình thái tế bào bám bằng SEM sau khi cố định, khử nước và làm khơ. Khảo sát sự phân bố các sợi actin để đánh giá điều kiện bám dính. Các tế bào MC3T3-E1 bám dính được nhuộm bằng rhodamine-phalloidin sau khi cố định formol 10%. Quan sát sợi actin nhuộm màu bằng kính hiển vi hùynh quang. Kết quả, các tế bào dạng thoi trải ra theo nhiều hướng tạo các liên kết giữa tế bào trên HA gốm. các tế bào trải rộng trên lớp apatite cĩ protein huyết thanh. Tuy nhiên, chỉ cĩ các tế bào MC3T3-E1 là cĩ khả năng tăng trưởng trên lớp apatite cĩ protein huyết thanh. Vì vậy, sự khác biệt trong đáp ứng của tế bào trên lớp apatite được cảm ứng bởi protein dính và sự thực bào. Apatite lắng cĩ đặc tính là hấp thu mạnh với các protein dính tế bào như fibronectin và vitronectin. Hơn nữa, các tế bào MC33-E1 với khả năng thực bào cĩ thể sử dụng phần bên trong của lớp tạo thành chứa protein dính. Như vậy, lớp apatite cĩ protein huyết thanh cĩ thể được sử dụng làm scaffold tăng trưởng tế bào trong kỹ nghệ mơ xương.