A. Định tính các nhóm chất thường có trong dược liệu bằng các phản ứnghóa học. hóa học.
♦♦♦ Định tính Flavonoid.
Lấy 5g bột dược liệu cho vào bình nón, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thủy 10 phút, lọc nóng, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
+ Phản ứng Cyanidin: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm một ít bột magie kim loại, thêm tiếp vài giọt HC1 đặc, đun cách thủy thấy dịch chiết chuyển từ mầu xanh sang màu nâu đỏ (Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng với FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện mầu xanh đen (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận trong dược liệu cố flavonoid.
♦> Định tính alkaloid.
Cho khoảng 3g bột dược liệu đã làm nhỏ vào bình nón dung tích 100ml thêm 30ml dung dịch H2S04 2% đun sôi trong 20 phút. Để nguội, lọc dịch chiết làm các phản ứng.
+ Phản ứng thuốc thử Mayer.
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer. Không thấy xuất hiện tủa ở mẫu thử (Phản ứng âm tính).
+ Phản ứng với thuốc thử Bouchardat
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy có tủa nâu ở mẫu thử ( Phản ứng âm tính).
+ Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt thuốc thử không thấy kết tủa vàng cam hay đỏ ở mẫu thử ( Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận không có alcaloid trong mẫu thử.
Lấy 5g dược liệu đã làm nhỏ cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm
50ml cồn 25°, ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24h. Gạn dịch vào cốc có mỏ, loại
tạp bằng lượng thừa dung dịch chì acetate 20%, lọc loại tủa, loại chì acetate dư bằng dung dịch natri sulfat 30%, để lắng, lọc. Dịch lọc chuyển vào bình gạn và lắc kỹ với chloroform (10ml - 5ml - 5ml), gạn lấy lớp chloroform, loại nước bằng Na2S04 khan lọc. Chia đều dịch chiết vào các ống nghiệm nhỏ, bốc hơi dung môi trên nồi cách thủy cho đến khô.
Cắn còn lại hòa tan trong 4ml cồn 90° để làm các phản ứng định tính sau:
+ Phản ứng Liberman - Bouchardat:
Lấy lml dịch chiết cồn ở trên, thêm 0,5ml anhydrid acetic. Lắc đều, đặt
nghiêng ống nghiệm một góc 45°, sau đó thêm đồng lượng H2S04 đặc theo
thành ống nghiệm ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng thấy xuất hiện vòng
tím đỏ ( Phản ứng dương tính). + Phản ứng Baljet:
Lấy lml dịch chiết cồn ở trên, thêm 0,5ml thuốc thử Baljet vừa mới pha
gồm 9,5ml acid picric và 0,5ml dung dịch NaOH 10% không thấy xuất hiện
mầu da cam ở mẫu thử ( Phản ứng âm tính).
+ Phản ứng Legal:
Lấy lml dịch chiết cồn ở trên, thêm 3 giọt thuốc thử natro prusiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10% không thấy xuất hiện màu đỏ ở mẫu thử (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận mẫu nghiên cứu không có glycosid tỉm.
❖ Định tính antraglycosid: + Phản ứng Bomtrager:
Lấy lg dược đã tán nhỏ cho vào ống nghiêm to, thêm dung dịch H2S04 10% tói ngập dược liệu rồi đun cách thủy trong vòng 15 phút. Lọc, để nguội, lắc với ether ethylic trong 2 phút, để yên cho phân lớp gạn lấy lớp ether
ethylicvà thêm vào đó 8ml dung dịch NaOH 10% lớp kiềm không có mầu đỏ (Phản ứng âm tính).
Kết luận mẫu thử không có antraglycosid.
❖ Định tính tannin:
Cho vào bình nón dung tích 100ml khoảng 2g dược liệu, thêm vào 20ml nước cất, đun sôi trên bếp qua lưới amian trong thời gian khoảng 10 phút, lọc nóng, dịch lọc dược làm các phản ứng:
+ Phản ứng vói dung dịch FeCl3 5%:
Lấy lml dung dịch thử cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% thấy xuất hiện mầu xanh đen ở mẫu thử ( Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng vói gelatin 1%:
Lấy lml dung dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt gelatin 1%
thấy kết tủa bông trắng ở mẫu thử (Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng với dung dịch chì acetate 10%:
Cho lml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt chì acetate 10%, thấy xuất hiện tủa bông (Phản ứng dương tính).
+ Phản ứng vói đồng acetate 10%:
Cho lml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt đồng acetate 10% , thấy xuất hiện kết tủa (Phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận mẫu nghiên cứu cố tanỉn.
❖ Định tính Saponin:
+ Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm lg dược liệu cùng 5ml nước, đung sôi nhẹ, lọc nóng. Dịch lọc thu được hòa loãng với 10ml nước lắc mạnh trong 1 phút, rồi để yên trong 15 phút. Quan sát thấy cột bọt bền vững.
Lấy khoảng lg dược liệu, chiết bằng cồn 90° trên nồi cách thủy trong 10 phút, lọc nóng, được dịch chiết cồn. Cho dịch chiết cồn vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 5 ml.
ống 1: Thêm 5ml NaOH 0,1N ống 2: Thêm 5ml HC1 0,1N
Lắc dọc theo ống nghiệm trong vòng 5 phút. Quan sát thấy cột bọt trong ống 2 cao hơn ống 1. Kết luận saponin trong dược liệu là loại triterpenoid.
+ Quan sát hiện tượng phá huyết:
Cho lg bột dược liệu vào 10ml dung dịch NaCl 0,9% đun cách thủy trong vòng 30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc nhỏ 1 giọt máu thỏ 2% đã loại Fibrin lên lam kính, đậy lamen nhỏ 1 giọt dung dịch lọc ở trên vào 1 cạnh lamen. Quan sát dưới kính hiển vi thấy hồng cầu bị vỡ ra khi dịch chiết thấm vào.
Sơ bộ kết luận có saponin triterpenoid
❖ Định tính Coumarin:
Lấy lOg bột dược liệu cho vào bình nón có dung tích 100ml, thêm 50ml cồn 90°, đun cách thủy sôi 5 phút, lọc nóng lọc qua giấy lọc. Dịch chiết thu được đem làm phản ứng sau:
+ Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống lml dịch chiết, ống 1: Thêm 0,5ml
dung dịch NaOH 10%, ống 2: để nguyên, đun cả 2 ống nghiệm trên nồi cách thủy đến sôi. Quan sát thấy:
ống 1: Dịch chiết có tủa đục ống 2: Dịch chiết vẫn trong
Thêm cả 2 ống nghiêm mỗi ống 2ml nước cất, lắc đều rồi quan sát thấy: ống 1: Dịch chiết vẫn có tủa đục
ống 2: Dịch chiết vẫn trong ( Phản ứng âm tính).
+ Phản ứng diazo:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm 2ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thủy đến sôi, để nguội thêm vào vài giọt thuốc thử diazo, không thấy trong ống nghiệm kết tủa đỏ gạch ( phản ứng âm tính).
+ Phản ứng vi thăng hoa:
Cho lmg bột dược liệu vào 1 nắp chai bằng nhôm. Hơ lên đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu. Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính trên đó có để một miếng bông ướt, đặt nắp nhôm trực tiếp trên nguồn nhiệt. Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưói kính hiển vi, không thấy có tinh thể hình kim nào xuất hiện ( phản ứng âm tính).
+ Quan sát huỳnh quang: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt NaOH 5% sấy nhẹ. Che 1/2 vết bằng đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi, nửa hình tròn không che và nửa hình tròn che sáng như nhau (phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận không có coumarin trong mẫu thử.
❖ Định tính chất béo, Caroten, Sterol:
Ngâm lOg bột dược liệu trong bồn hình nón bằng ether dầu hỏa, để qua đêm. Lọc lấy dịch đem làm phản ứng:
+ Định tính chất béo:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết này lên 1 miếng giấy lọc để khô rồi quan sát: Không thấy có vết đục mờ trên miếng giấy lọc ( phản ứng âm tính).
+ Định tính carotene:
Lấy 2ml dịch chiết ether dầu hỏa cho vào ống nghiệm nhỏ, bốc hơi cách thủy tới cạn. Cho thêm 2 giọt dung acid sunfuric đặc vào, thấy mầu dung dịch chuyển sang mầu xanh da trời ( phản ứng dương tính).
+ Định tính Sterol:
Lấy lml dịch chiết ether dầu hỏa bốc hơi tới cạn, cho thêm lml anhydrid acetic lắc kỹ. Đặt nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm từ 0,5ml H2S04
đặc theo thành ống nghiệm. Quan sát thấy mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng có vòng tím đỏ ( phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận cố Sterol, carotene và không cố chất béo trong mẫu thử.
*** Định tính đường khử, acid hữu cơ, acid amin, Polysaccharid:
Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm to, thêm 10ml nước, đun cách thủy trong vòng 10 phút. Lọc lấy dịch lọc đem định tính:
+ Định tính đường khử:
Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy 5 phút, thấy trong ống nghiệm kết tủa đỏ gạch ( phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận cố đường khử trong mẫu thử
+ Định tính acid hữu cơ:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm và cho thêm 1 ít tinh thể Na2C 03 thấy bọt khí nổi lên (phản ứng dương tính).
Sơ bộ kết luận cố acid hữu cơ trong mẫu thử.
+ Định tính acid amin:
Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, nhỏ 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%. Đun cách thủy 7 - 1 0 phút, không thấy xuất hiện mầu xanh tím ( phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận không có acid amin trong mẫu thử.
+ Định tính Polysaccarid:
Cho 4ml dịch chiết vào ống nghiệm to (ống số 1), thêm 5 giọt thuốc thử Lugol, dung ngón tay cái bịt đầu ống nghiệm, lắc nhẹ nhàng cho thuốc thử được trộn đều. Tiến hành đồng thời với một ống chứng (ống số 2) gồm 4ml nước cất có thêm 5 giọt thuốc thử Lugol. Kết quả: ống số 1 có mầu đỏ đậm hơn ống số 2 ( phản ứng dương tính).
(Thuốc thử Lugol được pha như sau: Lấy 0,5g I2 và l,0g KI pha trong 100ml nước cất. Đựng trong lọ mầu).
Bảng 1: Kết quả định tính các nhóm chất trong dược liệu. STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận 1 Flavonoid Phản ứng Cyanidin + có Phản ứng với FeCl3 +++ 2 Phản ứng với các TT: Alcaloid TT Mayer - TT Dragendorff - Không TT Bouchardat - 3 Phản ứng Liberman +
Glycosid tim Phản ứng Baljet - Không
Phản ứng Lergan -
4 Athraglycosid Phản ứng Bomtrager - Không
5 Phản ứng với FeCl3 +++ Phản ứng với Gelatin +++ Tanin Phản ứng với dd chì Acetat 10% +++ có Phản ứng với dd đồng Acetat 10% +++
6 Hiện tượng tạo bọt +++
Saponin Quan sát hiện tượng có
phá huyết +++
7 Phản ứng đóng mở
vòng Lacton. -
Coumarin Phản ứng Diazo - Không
Phản ứng vi thăng hoa -
Quan sát huỳnh quang -
9 Caroten Phản ứng với H2S04 đặc + Có 10 Sterol Phản ứng Liberman + Có 11 Đường khử Phản ứng với TT Fehling A Fehling B + Có
12 Acid hữu cơ Phản ứng vối Na2C 03 + Có
13 Acid amin Phản ứng với TT
Ninhydrin - Không
14 Polysaccarid Phản ứng với TT lugol ++ Có
Nhận xét: trong dược liệu có flavonoid, saponin, tannin, caroten, sterol, đường khử, acid hữu cơ, polysaccaride. Không có coumarin, alcaloid, glycosid tim, chất béo, acid amin, antraglycosid.