- Lõi ngô,vỏ trấu, vỏ lạc được sấy khô và nghiền nhỏ. - Carboxylmethyl cellulose (CMC).
2.1.2 Môi trƣờng
2.1.2.1 Môi trường bảo quản và giữ giống
Hóa chất Nồng độ Đường saccarose 30 g/l NaNO3 10 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l NaCl 1% FeSO4 (dạng vết) 1 – 2 hạt Thạch agar 20 g/l H2O 1,0 l KH2PO4 2,0 g/l
2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường Czapek- Dox cơ sở thay sacaroza bằng lõi ngô (vỏ trấu, vỏ lạc..). Hóa chất Nồng độ NaNO3 10 g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l NaCl 1% FeSO4 (dạng vết) 1 – 2 hạt Thạch agar 20 g/l H2O 1,0 l KH2PO4 2,0 g/l
2.1.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme
Môi trường Czapek- Dox cơ sở thay sacaroza bằng CMC (cacboxyl methyl cellulose). Hóa chất Nồng độ NaNO3 1,5g/l MgSO4.7H2O 0,5 g/l KCl 0,5 g/l NaCl 1% CMC 1% Thạch agar 20 g/l H2O 1,0 l KH2PO4 2,0 g/l
2.1.3 Hóa chất- thiết bị
2.1.3.1 Hóa chất
- Giấy lọc (Trung Quốc), cacboxyl methyl cellulose (CMC), thuốc thử lugon đỏ 1%.
- Các hóa chất: KCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2SO4, NaCl… các hóa chất đều
tinh khiết ở mức tinh khiết.
2.1.3.1 Thiết bị
- Tủ ấm, tủ sấy Binder( Đức), nồi hấp, máy lắc, máy li tâm, cân…các dụng cụ và thiết bị thông dụng khác của phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa Sinh- KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh
* Hoạt hóa các vi sinh vật
Các vi sinh vật được giữ trong môi trường thạch nghiêng thích hợp mỗi
loại ở 40C trong tủ lạnh. Khi nhận được các giống vi sinh vật, hoạt hóa giống
cấy lên bề mặt môi trường mới trong hộp petri. Sau khi vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc riêng rẽ, cấy truyền sang các ống nghiệm chứa các môi trường giữ giống tương ứng cho mỗi loại vi sinh vật. Sau đó đặt các ống
nghiệm trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 3 ngày rồi cất vào tủ lạnh ở 40C để
giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo. Cấy truyền định kỳ và liên tục. * Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi sinh vật, pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet lấy 0,1ml dịch huyền phù trải
đều trên mặt môi trường trong hộp petri. Nuôi cấy ở tủ ấm 28-300C đối với
nấm mốc. Sau 3 ngày đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong hộp petri, từ đó tính ra số lượng tế bào trong 1g (hoặc 1ml) mẫu lúc ban đầu theo công thức:
( / ) ab X CFU g V Trong đó:
X: Tổng số CFU (Colony Forming Unit) trong 1g (hoặc 1ml)
mẫu.
a: Số CFU trung bình đếm được trên một hộp petri ( số tế bào
trong 100µl dịch huyền phù mẫu phân tích ở độ pha loãng nhất định).
b: Số lần dịch được pha loãng.
V: Thể tích dịch huyền phù dùng để cấy (ml).
2.2.2 Phƣơng pháp hóa sinh
* Nuôi cấy chủng nấm để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường giữ giống trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 5 đến 7 ngày.
2.2.2.1 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm
Định tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một điểm vào môi trường đĩa thạch chứa 1% cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm 3- 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử lugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d, cm).
Với D: là đường kính vòng phân giải. d : là đường kính khuẩn lạc.
2.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983)
Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên môi trường thử hoạt tính, tương ứng với từng loại enzyme. Nhỏ vào mỗi lỗ khoan 100µl dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h - 8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch
sau đó cho vào tủ ấm ở 300
dịch thuốc thử lugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d, cm).
Với D: là đường kính vòng phân giải. d : là đường kính lỗ đục.
2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của cellulase
+ Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của cellulase
Cho cellulase phản ứng với CMC trong 30 phút trong các dung dịch đệm (dung dịch NaOH 1N và HCl 1N) có pH khác nhau từ 2-7. Xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
+ Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung d ịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các
nhiệt độ khác nhau từ 250C- 400C trong 30h. Hoạt tính cellulase của các dịch
được xác định theo phương pháp cấy chấm điểm.
+ Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dịch cellulase và dung d ịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức thời gian khác nhau từ 1-5 ngày. Sau mỗi ngày xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm.
+ Xác định ảnh hưởng của nguồn celulose tự nhiên
Nguồn cacbon lần lượt được sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi cấy chủng trong thời gian 4 ngày. Sau đó lấy dịch đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong d ịch nuôi cấy bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
+ Xác định ảnh hưởng của các nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek- Dox thích hợp
với nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4
khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose
Theo các phương pháp nghiên cứu như trên chúng tôi đã phân lập được 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase, kết quả này cho thấy các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở Vĩnh Phúc khá là đa dạng. Hoạt tính cellulase của các chủng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose (D-d, cm)
STT Chủng vi sinh vật Hoạt tính STT Chủng vi sinh vật Hoạt tính 1 M1-1 0,6 16 M5-3 2,0 2 M1-2 1,3 17 M5-6 1,3 3 M1-3 0,5 18 M6-1 1,8 4 M1-4 1,1 19 M6-2 1,1 5 M2-1 0,7 20 M6-3 1,0 6 M2-2 1,2 21 M6-4 0,6 7 M2-3 0,5 22 M7-1 0,7 8 M3 2,2 23 M7-2 1,3 9 M3-2 1,0 24 M7-3 1,5 10 M3-3 1,2 25 M8-1 0,5 11 M3-6 1,1 26 M8-2 0,6 12 M4-1 1,0 27 M8-3 0,7 13 M4-2 0,8 28 M9-1 1,2 14 M4-3 0,7 29 M9-2 1,3 15 M5-1 0,8 30 M9-3 1,4
Hình 3.1 Khả năng sinh cellulase của các chủng được nghiên cứu
Trong số 30 chủng mốc có khả năng phân giải cellulose của phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Sinh- KTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 có 3 chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase mạnh nhất đó là các chủng có kí hiệu M 3, M5-3 và
M 6-1. Tuy nhiên khả năng sinh cellulase của chủng M3 là tốt hơn so với chủng M 5-3 và M 6-1.Ba chủng này sẽ được tiến hành nghiên cứu sâu hơn nhằm ứng dụng trong thực tiễn bổ sung vào nguồn thức ăn gia súc. Có thể hy vọng rằng ba chủng tuyển chọn sinh trưởng và phát triển trên nguồn cơ chất rẻ tiền, có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme với hoạt tính cao sẽ có nhiều ứng dụng hiệu quả trong thực tiễn, đặc biệt tuyển chọn các chủng sinh enzyme để bổ sung vào thức ăn cho chăn nuôi.
Bằng phương pháp nhận diện truyền thống, chúng tôi đã bước đầu xác định được một số đặc điểm về hình thái của 3 chủng nấm mốc M3, M 5-3 và M 6-1. Từ kết quả đó chúng tôi đem so sánh với các đặc điểm của các chi, loài trong các khóa phân loại và thấy:
- Chủng M3 có những đặc điểm giống với chi Penicillium ( Samson và
ctv. 1995) như: trên môi trường Crapek-Dox khuẩn lạc màu xanh lục, xanh
đen, mặt sau khuẩn lạc có màu nâu tối, giá bào tử trần phân nhánh, bông nấm hình cột dạng xẻ thùy, thể bình thuộc dạng lưỡng tầng, bào tử có hình ovan đến hình cầu.
- Chủng M5-3có những đặc điểm rất giống với chi Aspergillus (Raper &
Fennell, 1965) như: trên môi trường Crapek-Dox khuẩn lạc màu vàng hoa
cau, màu đen nâu, mặt sau màu vàng tối, giá bào tử trần không phân nhánh, thẳng, nhẵn hoặc hơi ráp, bông nấm màu đen hơi nâu, hình bán cầu cho đến hình cầu, bọng đỉnh giá hình gần cầu, chỉ có một lớp thể bình, bào tử trần hình cầu, elip, hơi nhẵn hoặc nhẵn[18].
- Riêng chủng M6-1 đã được chúng tôi nghiên cứu sâu hơn và xác định chủng M6-1 thuộc nhóm loài A. niger (Raper & Fennell, 1965)[18].
3.2 Ảnh hƣởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M 3, Aspergillus M5-3 và A. niger M 6-1
3.2.1 Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh cellulase
pH là một trong các yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và tổng hợp enzyme của nấm mốc. Để xét ảnh hưởng của yếu tố này, tôi tiến
hành nuôi cấy chủng Penicillium M 3, Aspergillus M5-3 và A.niger M 6-1
trong môi trường Czapek- Dox. Sau 4 ngày nuôi cấy, xác định hoạt tính cellulase theo phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.2.1.Kết quả được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính cellulase
pH M5-3 (D-d,cm) M3 (D-d,cm) M 6-1 (D-d,cm) 2 0,3 0,6 0,5 3 0,5 1,0 0,7 4 1,0 1,9 1,5 5 2,0 2,3 1,8 6 0,9 1,2 0,9 7 0,7 0,9 0,8
Hình 3.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh cellulase
Kết quả cho thấy, đối với chủng Penicillium M3 có khả năng sinh
cellulase tốt ở điều kiện pH= 2 và đạt cực đại ở pH= 5, sau đó khả năng sinh cellulase giảm dần ở điều kiện pH tiếp theo (pH=6, pH=7).
Đối với chủng Aspergillus M5-3 có khả năng sinh cellulase tốt ở điều kiện pH=3 và đạt cực đại ở pH= 5, sau đó khả năng sinh cellulase giảm dần ở các điều kiện pH tiếp theo (pH=6, pH=7).
Đối với chủng A. niger M6-1 có khả năng sinh cellulase tốt ở điều kiện
pH=4 và đạt cực đại ở pH= 5, sau đó khả năng sinh cellulase giảm dần ở các điều kiện pH tiếp theo (pH=6, pH=7).
Khả năng sinh trưởng và sinh cellulase của hai chủng Penicillium M3,
Aspergillus M5-3 và A.niger M 6-1 tốt nhất ở điều kiện môi trường axit, chúng có khả năng sinh cellulase ngay cả khi pH= 2. Tuy nhiên khả năng sinh cellulase của chủng Penicillium M3 mạnh hơn và dải pH= 3-6 dài hơn so với dải pH của chủng Aspergillus M5-3 và A. niger M6-1 (pH= 4-5).
Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH= 4,5 - 6,0 ( Đặng Minh Hằng, 1999).
3.2.2 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Tiến hành nuôi cấy ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 và A.
niger M6-1 được tuyển chọn trong môi trường thích hợp (phần2.1.2.2).
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase của ba chủng được tuyển chọn bằng phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.2.3. Hoạt tính cellulase của các dịch phản ứng được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 và hình 3.3.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase
Nhiệt độ (0C) M5-3 (D-d,cm) M3 (D-d,cm) M6-1 (D-d,cm) 25 0,7 1,1 0,6 30 1,2 2,2 1,6 35 1,1 2,0 0,9 40 1,0 1,5 0,8
Hình 3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính cellulase
Hình 3.4 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3, AspergillusM5-3 ở 250C
Hình 3.5 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3, AspergillusM5-3 ở 300C
Kết quả cho thấy cả ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 và A.
niger M6-1 cho khả năng sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 300C, sau đó khả năng sinh tổng hợp cellulase của ba chủng giảm dần ở các mức
nhiệt độ tiếp theo (400C).
Các chủng nấm thường là các chủng ưa nhiệt và nhiệt độ tối ưu cho khả
năng sinh tổng hợp cellulase là 300
C trong các nhiệt độ khảo sát . Những nghiên cứu trước đây cho thấy, các chủng nấm khác cũng sinh tổng hợp
cellulase mạnh nhất ở dải nhiệt độ 310C- 340C (Đặng Minh Hằng, 1999).
3.2.3 Ảnh hƣởng của thời gian
Chủng được nuôi cấy trong môi trường Czapek- Dox (phần 2.1.2.2) với các mức thời gian khác nhau từ 1-5 ngày. Sau mỗi ngày, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch li tâm
bằng phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.6.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Thời gian (ngày) M5-3 (D-d,cm) M3 (D-d,cm) M6-1 (D-d,cm) 1 0.37 0.41 0.35 2 0.59 0.8 0.6 3 0.8 0.9 0.68 4 1.0 1.2 0.9 5 0.5 0.63 0.63 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 (ngày) 1 2 3 4 5 D -d , c m Thời gian M5-3 M3 M6-1
Hình 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính cellulase
Qua số liệu ở bảng 3.4 và hình 3.6, tôi nhận thấy hoạt tính cellulase của ba chủng tăng dần theo thời gian và cả ba chủng đều đạt giá trị cực đại sau ngày nuôi cấy thứ 4. Qua ngày nuôi cấy thứ 4, hoạt tính của ba chủng đều
giảm dần có thể do sinh trưởng của nấm mốc giảm dần, nguồn dinh dưỡng cạn kiệt…
Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây trên các chủng nấm sợi ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 72h - 96h nuôi cấy. Cả ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 và A. niger M6-1 có thời gian và khả năng sinh tổng hợp cellulase tương đương với các chủng nấm sợi đã nghiên cứu. Như vậy thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của ba chủng được tuyển chọn.
3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Để phân giải polysaccarit khó phân giải như cellulose thì tế bào vi sinh vật phải tổng hợp một lượng lớn cellulase, vì thế quá trình sinh tổng hợp có thể cần tới lượng lớn nitơ, có chủng có thể sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme. Vì vậy, ngoài việc nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng nấm mốc để lên men cũng có ý nghĩa quan trọng.
Ba chủng nấm Penicillium M3, Aspergillus M5-3 và A. niger M6-1 tuyển chọn được nuôi cấy trên môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1)
với nguồn nito được sử dụng lần lượt là NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4
trong thời gian là 4 ngày. Sau đó, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi cấy theo phương pháp đã được trình bày ở phần 2.2.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.7.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase Nguồn nitơ M5-3 (D-d,cm) M3 (D-d,cm) M6-1 (D-d,cm) NaNO3 1.7 2.1 1.5 NaNO2 0.8 1.6 0.9 NH4Cl 1.4 1.8 1.3 (NH4)2SO4 1.1 2.0 1.2
Hình 3.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Qua kết quả ở bảng số liệu, nhận thấy ba chủng đều có khả năng sử dụng
nhiều nguồn nitơ và NaNO3 là nguồn nitơ tốt nhất cho cả ba chủng sinh tổng
hợp cellulase. Điều này phù hợp với nhiều nghiên cứu cho rằng nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase ở nhiều nấm sợi như Aspergillus,
Hình 3.8 Khả năng sinh cellulase của chủng Penicilium M3 trên nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và NaNO3
Hình 3.9 Khả năng sinh cellulase của chủng AspergillusM5-3 trên nguồn nitơ là (NH4)2SO4 và NaNO3
Hình 3.10 Khả năng sinh cellulase của chủng A. niger M6-1 trên nguồn