Tiến hành chọn lọc ngẫu nhiên nhằm cải tạo giống v s v , kết quả của một số dạng chủng có hoạt tính tốt được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Kí hiệu p .mirabilis S.aureus
dạng chủng D(mm) s í>(mm) s 1 18,90 1,42 26,64 1,21 2 19,27 0,91 26,40 0,97 3 19,70 0,54 26,93 1,12 4 17,91 0,65 25,92 0,65 5 18,35 0,51 25,45 1,82 6 17,83 0,62 24,17 2,68 7 18,95 0,76 27,21 0,57 8 18,80 0,16 24,65 1,76 9 17,11 0,51 24,47 1,96 10 18,00 0,58 23,77 1,54 11 16,27 0,25 23,63 2,64 12 19,45 0,34 24,67 2,72 Nỉỉận xét:
Từ kết quả chọn lọc ngẫu nhiên trên đây, chúng tôi chọn ra các chủng có hoạt tính sinh kháng sinh cao để tiếp tục tiến hành các nghiên cứu tiếp theo : 27222.1, 27.222.2, 27.222.3, 27.222.7.
2.2.4. K ết quả đột biến bàng ánh sáng u v
Tiến hành đột biến Streptomyces 27222 bằng ánh sáng u v thu được kết quả sau: - Độ sống sót sau đột biến: 0,12%.
- Sàng lọc sau đột biến: tuyển chọn ngẫu nhiên được 36 chủng, kết quả của một số chủng có đột biến dưofng được trình bày ở bảng 2.7.
Kí hiệu biến chủng p.mirabilis S.aureus D (mm) s % biến đổi hoạt tính D(mm) s % biến đổi hoạt tính 1 18,51 0,85 125,92 30,84 1,67 112,60 2 20,63 0,91 140,34 33,00 0,45 120,48 3 19,77 0,68 134,50 31,55 1,01 115,19 4 17,67 0,85 120,20 32,65 1,00 119,20 5 18,51 1,33 125,92 32,31 0,30 117,96 6 18,14 0,61 123,40 32,22 2,04 117,63 7 18,48 0,42 125,71 31,30 1,22 114,28 8 17,21 0,18 117,08 29,28 1,31 111,24 9 18,65 0,37 126,87 30,85 2,02 117,21 10 17,34 0,36 117,96 30,61 0,59 116,30 11 17,27 0,25 117,48 30,99 0,89 117,74 12 17,02 0,66 115,78 31.27 0.09 118,80 13 17,00 0,20 115,65 30,98 1,00 117,70 Gốc 14,70 0,42 100,00 27,39 2,87 100,00
Dựa vào bảng kết quả trên chúng tôi lựa chọn các chủng có sự biến đổi hoạt tính kháng sinh cao để tiếp tục làm các nghiên cứu tiếp theo: 27.222.3.2; 27.222 3 3 ; 27.2223.5; 27.22237; 272223.9.
2.2.5. Kết quả lựa chọn dung môi chiết thích hợp
Chúng tôi tiến hành chiết lặp 3 lẩn đối với dịch lọc kháng sinh tại các pH 3,5,7,9,11 với các dung môi khác nhau: Butyl acetat, ethyl acetat, n-butanol, dichloromethan, chloroform và thu được kết quả chiết trên hai dung môi chiết tốt nhất sau; với vsv kiểm định là Staphylococcus aureus. Kết quả được trình bày ở bảng 2.8.
Bảng 2.8: Kết quả chọn lọc pH và dung môi chiết thích hợp.
pH
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Ethylacetat
Pha nước Pha dmhc
n-Butanol
Pha nước Pha dmhc
6,22 30,37 6,52 28,28 0,00 32,67 6,02 31,67 0,00 29,27 6,00 28,82 6,36 26,25 6,68 26,44 11 6,72 20,83 6,92 28,60 Nhận xét:
- Hai dung môi ethỵlacetat và n-butanol đều chiết kiệt dịch lọc ở pH5 và pH7, - Tại pH5 cho kết quả chiết tốt nhất.
Chúng tôi lựa chọn ethylacetat làm dung mồi chiết cho các thí nghiêm tiếp theọ
2.2.6. Kết quả lẻn men chìm
Chọn chủng 27.222.3 để xét sự ảnh hưởng của các môi trường đến hoạt tính của dịch lọc sau khi lên men chìm. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.9.
Bảng 2.9: Kết quả xét sự ảnh hưởng của thành phần môi trường đến hoạt tính kháng sỉnh khi lên men chìm.
Môi trường p.mirabilis s.aureus D(mm) s D(mm) s MTl 19,55 0,26 23,90 0 J 9 MT2 18,14 0,47 22,18 0,62 MT7 19,00 1,89 21,46 1,65 Nhận xét:
- MTl là môi trường lên men chìm tốt nhất, đo khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của xạ khuẩn ở mồi trường này cao hcm so với các môi trường còn lạị
2.2.7. Kết quả chọn chủng có hoạt tính tốt khi lên men chìm
Sau khi chọn lọc một số biến chủng cho hoạt tính kháng sinh tốt từ kết quả chọn lọc tự nhiên và đột biến, chúng tồi tiến hành lên men chìm và thu được kết quả được trình bày ở bảng 2.10. ^
Bảng 2.10: Kết quả lên men chìm trên môi trường(^của một số chủng có hoạt tính tốt khi lên men bề mặt.
Kí hiệu chủng xạ khuẩn p.mirabilis S.aureus ỡ(m m ) 27.222 18,07 0,42 21,37 0,81 27.222.1 18,03 0,62 21,59 0,42 27.222.2 18,27 0,51 21,77 0,53 27.222.3 18,35 0,42 22,11 0,30 27.222.3.2 18,37 0,35 23,00 0,70 27.222.3.7 17,91 0,80 22,30 0,40 27.222.3,9 18,41 0,41 22,15 0,33
Nhận xét: Bảng kết quả lên men chìm cho thấy có một biến chủng sau chọn lọc tự nhiên là 27.2223 và hai biến chủng sau đột biến nhân tạo là 27.2223.2 và
27.222.3.9 cho hoạt tính kháng sinh tốt khi lên men chìm.
2.2.8. Kết quả thử ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền kháng sinh
Thí nghiệm được tiến hành với chủng vi khuẩn kiểm định là Proteus mirabiỉis.
Kết quả được trình bày ở bảng 2.11.
Bảng 2.Ỉ1: Kết quả thử ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh
Điều kiện tiến hành D(mm) s
Nhiệt độ phòng 18,70 0,25
Đun sôi cách thuỷ trong 45 phút 18,17 0,50 Đun sôi trực tiếp trong 30 phút 18,80 1,29
Nhận xét: kháng sinh do chủng Streptomyces 27.222 tổng hợp có hoạt tính bền vững với nhiệt độ.
2.2.9. Kết quả thử ảnh hưởng của pH đến độ bền kháng sinh
Thí nghiệm được tiến hành trên chủng Proteus mirabiỉi, kết quả được trình bày ở bảng 2.12.
Bảng 2.12; Kết quả thử ảnh hưởng của pH đến độ bền của kháng sình
pH Sau 1 ngày Sau 5 ngày
17,97 0,87 17,80 0,72 18,97 0,64 18,33 0,31 7 17,68 0,97 17,47 0,45 15,86 0,60 16,43 0,51 11 11,73 0,12 13,55 0,05 Nhận x é t:
- Dịch lọc kháng sinh do chủng Síreptomyces 27.222 bền vững ở khoảng pH tưofng đối rộng.
- Kháng sinh bền vững ò pH 5, vì vậy giữ dịch lên men ở pH 5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theọ
2.2.10. K ết quả thử kháng sinh nội bào
Sinh khối thu được sau lên men được giữ để thử kháng sinh nội bào, sử dụng dung môi hữu cơ là Ethylacetat, với v s v kiểm định là Proteus mỉrabilis, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 2.13.
Bảng 2.13; Một sô kết quả thử trên kháng sinh nộỉ bàọ
Thí nghiêm tiến hành Kết quả Thử hoạt tính kháng sinh với
Proteus mỉrabiỉis D (mm) = 15,24 s = 0,20
Thử hoạt tính kháng sinh với
Pseudomonas aeruginosa í>(mm) = 0,00 s = 0,00
Sắc ký song song với dịch chiết KS ngoại bào trên hệ 1
Kết quả cho thấy, thành phần kháng sinh của dịch ngoại bào và nội bào giống nhau
Nhận xét:
Chủng Streptomyces 27.222 có khả năng sinh kháng sinh nội bào với hoạt tính khá mạnh.
Kháng sinh nội bào có thành phần giống với kháng sinh ngoại bàọ
2.2.11. Kết quả thử tác dụng chống nấm của kháng sinh
Dịch chiết kháng sinh nội bào, ngoại bào được đem thử hoạt tính chống nấm bằng phưoíng pháp khoanh giấy lọc, vsv kiểm định là Candida aỉbicans và
Aspergiỉlus niger, chúng tôi thu được kết quả ở bảng 2,14.
Bảng 2.14: Kết quả thử hoạt tính kháng nấm của kháng sinh nội bào và ngoại bào do Streptomyces 27.222 sinh tổng hợp.
Kháng sinh
Candida albicans Aspergillus niger
Nội bào 0,00 0,00 0,00 0,00
Ngoại bào 0,00 0,00 0,00 0,00
Nhận xét:
Cả kháng sinh nội bào và kháng sinh ngoại bào do chủng Streptomyces 27.222
sinh tổng hợp đều không có hoạt tính chống nấm trên chủng Candida albicans và chủng Aspergillus niger.
2.2.12. K ết quả sác kí lớp mỏng
Dịch chiết ethylacetat của kháng sinh ở pH5 được sử dụng để chấm sắc ký lớp mỏng. Sau khi sử đụng 28 hệ đung môi, có một số hệ cho kết quả chạy là vết kháng sinh, một số hệ cho ra hai vết kháng sinh và một số hệ cho thấy địch chiết có một
vết kháng sinh, vsv kiểm định là Proteus mirabilis, ở đây, chúng tôi xin đưa ra một số hệ dung môi tách được ba vết kháng sinh:
Hệ 1: Butylacetat: aceton: triethylamin 1:2:1. Hệ 2: Ethylacetat : aceton: triethylamin 2:2:1.
Hệ dung môi Rf
Vết 1 Vết 2 Vết 3
Hệ 1 0,88 0,67 0,00
Hệ 2 0,84 0,66 0,00
Nhận xét:
Kết quả sắc ký cho thấy dịch chiết có ít nhất 3 vết kháng sinh, hiện hình bằng phưcmg pháp v s v .
Khi soi dưới ánh đèn tử ngoại thì các kháng sinh phát quang có Rf tương tự như phưcmg pháp hiện hình v s v .
2.2.13. K ết quả chạy sắc ký cột
Sau khi sắc ký lớp mỏng chúng tôi tiến hành chạy sắc ký cột với vật liệu nhồi là silicagel,
Chạy cột với đung môi rửa giải là hệ 1( từ phân đoạn 1 đến phân đoạn 18) và hệ dichloromethan : dimethyl formamid 2:1 ( từ phân đoạn 19 đến phân đoạn 33) thu được 33 phân đoạn, 5 ml/phân đoạn, sau đó đem thử hoạt tính kháng sinh của các phân đoạn bàng phưcíng pháp khoanh giấy lọc ta có kết quả ở bảng 2.16.
Bang 2.16; Ket qua thur boat tinh cac phan doan dich rura giài sau sâc kÿ côt
Phân S.aureus P.mirabilis Phân S.aureus P.mirabilis doan D(mm) s s doan D(mm) s û(m m ) s 1 0,00 0,00 0,00 0,00 18 0,00 0,00 0,00 0,00 2 14,73 1,12 12,06 0,36 19 0,00 0,00 0,00 0,00 3 20,33 0,52 16,39 0,15 20 0,00 0,00 0,00 0,00 4 21,73 0,23 17,30 0,09 21 0,00 0,00 0,00 0,00 5 20,67 0,42 16,73 0,50 22 0,00 0,00 0,00 0,00 6 14,73 0,28 13,31 0,28 23 0,00 0,00 0,00 0,00 7 11,57 0,48 10,57 0,60 24 9,68 0,55 9,60 0,08 8 14,13 0,12 11,35 0,47 25 9,91 0,57 8,34 0,28 9 13,16 0,25 10,78 0,41 26 13,51 0,51 12,93 0,36 10 10,82 0,76 10,38 0,24 27 6,52 0,25 6,02 0,32 11 10,06 0,18 8,30 0,63 28 0,00 0,00 0,00 0,00 12 9,22 0,37 8,21 0,23 29 0,00 0,00 0,00 0,00 13 7,13 0,20 7,02 0,28 30 0,00 0,00 0,00 0,00 14 7,10 0,41 6,05 0,53 31 0,00 0,00 0,00 0,00 15 0,00 0,00 0,00 0,00 32 0,00 0,00 0,00 0,00 16 0,00 0,00 0,00 0,00 33 0,00 0,00 0,00 0,00 17 0,00 0,00 0,00 0,00
Tù bang kê't qua chûng tôi cô biéu d6 mô'i lien hê giîîa dir6ng kinh vông vô khu^n à càc phân doan trong sâc ki Icfp mông và câc vét hoat chat trong sâc kÿ 16p mông trên hînh 2. 1.
Nhân xét:
Chüng tôi cho râng, câc dînh trên hînh 2.1 tiïcfng ling vôi câc vêt khâng sinh dà nhân ditofc à sâc kÿ Idp mông.
Sau khi chay sâc kÿ côt xong, chüng tôi tiên hành sâc ki phân doan co hoat tinh vôi hê dung môi là hê 1. Két quà thu duçrc à bâng 2.17.
đưòíng kmh vòng vô khuẩn
đường kính vòng vô khuẩn
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31
Phân đoạn
Hình 2.1: Sơ đồ biểu diễn mối liên quan giữa hoạt tính kháng sình các phán đoạn và 3 vết kháng sinh của dịch chiết.
Bảng 2.17; kết quả sắc ký mỏngcác phàn đoạn có hoạt tính.
Phân đoạn Rf Vết tương ứng
2 0,88 Vết 1 3 0,86 Vết 1 4 0,88 Vết 1 5 0,87 Vết 1 6 0,86 Vết 1 7 0,86 và 0,65 Vết 1; vết 2; 8 0,65 Vết 2 9 0,66 Vết 2 10 0,64 V êt2 25 0,00 Vết 3 26 0,00 Vết 3
Nhận xét:
Kết quả thu được cho thấy phân đoạn 2 3 ,4,5,6 chứa kháng sinh tưcmg ứng với kháng sinh có Rf = 0,86 ở hệ 1.
Phân đoạn 8 là phân đoạn chính của chất thứ hai và khi thay đổi hệ dung môi chạy sắc ký cột, thu được phân đoạn 26 có hoạt tính mạnh, khi sắc ký thấy kết quả tucfng ứng với vết thứ 3.
Khi để một thời gian, chúng tôi thử hoạt tính kháng sinh của phân đoạn 26 thì bị mất hoạt tính kháng sinh, như vậy kháng sinh ở vết thứ 3 khồng bén ở điều kiện bình thường.
Phần 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. Kết ỉuận
Qua quá trình thực nghiệm, chúng tôi đă hoàn thành được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả sau:
• Kết quả phân loại ISP chúng tôi xác định được Streptomyces 27.222 có nhiều đặc điểm phân loại đặc trưng giống với của Streptomyces sinensis ( 92,86%).
• Streptomyces 27.222 là xạ khuẩn phân lạp được từ cơ chất Việt Nam, có hoạt phổ rộng, tác dụng tốt trên cả vi khuẩn Gr(-) và Gr(+).
• Khi nuôi cấy trên bề mặt Streptomyces 27.222 sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất trên môi trường 7, khi lên men chìm cho kết quả thử hoạt tính kháng sinh tốt nhất trên môi trường MTlđ.
• Đột biến cải tạo giống, thu được các chủng sau có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh tốt hga chủng gốc ìầ 27.222.32,27.222J , 27.222.3.5,27222.3.7,27.2223.9.
• Kháng sinh do Streptomyces 27.222 tổng hợp bén vững ở pH5, và đây cũng là pH tối ưu cho quá trình chiết.
• Kháng sinh được chiết tốt với dung môi ethylacetat và dung môi n-butanol. • Kết quả sác ký lớp mỏng cho thấy kháng sinh có ít nhất 3 thành phần.
3.2. Đề xuất
• Chúng tôi đề nghị nghiên cứu tiếp về các yếu tố ảnh hưởng để có quy trình chiết tách và tinh chế phù hợp.
• Tiến hành cải tạo giống để thu được biến chủng có hoạt tính kháng sinh ngày càng tốt hơn.
• Lên men trên quỵ mô lớn để thu được một lượng lớn cắn kháng sinh để tinh chế, để xác định cấu trúc...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Bộ môn Dược lý (2004), Dược lý lĩ, Trường Đại học Dược Hà Nộị 2. Bộ môn Hoắ dược (2004), Hữá dược //, Trường Đại học Dược Hà Nộị
3. Bộ môn Hoá phân tích (1998), Hoá phân tích //, Trường Đại học Dược Hà Nộị 4. Bộ môn Vi sinh- sinh học (2005), Vi sinh học, Trưòíng Đại học Dược Hà Nộị 5. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học,
NXB giáo dục.
6. Nguyễn Đức Huệ (2005), Các phương pháp phán tích hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia Hà Nộị
7. Từ Minh Koóng (2004), Cơ sở công nghệ sinh học và kỹ thuật sản xuất dược phẩm, NXB y học.
8. Kurt Randerath (1974), Nguyễn Hữu Bảy, Trần Trung Nam (dịch), sẳc ký lớp mỏng, NXB y học.
9. Lê Đình Lưcmg, Phan Cự Nhân (2000), Cơ sỏ di truyền học, NXB giáo đục. 10. Đỗ Thị Thuý Nga (2004), Nghiên cứu chủng Streptomyces 27.222 cố khả năng
sinh tổng hợp kháng sinh, khoá luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, Hà Nộị
11. Hổ Viết Quí (2001), Chiết tách, phân chia, xác định cấc chất hằng dung môi hữu cơ, tập 1, NXB Khoa học và Kỹ thuật.
Tài liệu tiếng Anh:
12. Annaliesa s. Anderson and Elizabeth M. H. Wellington (2001), “The taxonomy of Streptomyces and related genera”. International Journal o f Systematic and Evolutionary Microbiology, No 51, p. 797- 814.
13. ẸB Shirling and D.Gottleib (1966), “Method for characterization of Streptomyces species”, intJ.Syst. Bacteriol., Vol. 16, No, 3, p. 313-340.
14. Greg ọ Buchanan, Rika Regentin, Misty Piagentini, Andreas Rascher, Robert McDaniel, Jorge L. Galazzo, and Peter J. Licari (2005), “Production of 8- Demethylgeldanamycin and 4,5-Epoxy-8-demethylgeldanamycin from a
Recombinat Strain of Streptomyces hygroscopicus”, J. Nat. Prod., Nọ 68, P. 607-610.
15. Toshikazu Komoda, Madoka Kishi, Naoki Abe, Yasumasa Sugiyama, and Akira Hirota (2004), “ Novel Lipoxygenase Inhibitors, Tetrapetalone B,C, and D from Streptomyces sp.”, Biosị Biotechnol. Biochem., Vol. 4, Nọ 68, P. 903-908.
PHỤ LỤC
Hình 1: hình ảnh chuỗi bào tử của Streptom yces 27.222.
Hình 3: Kết quả chọn lọc tự nhiên.
Hình 4: Kết quả thử hoạt tính kháng sinh với dung môi chiết ethylacetat ở các pH khác nhaụ
Hình5: Kết quả lựa chọn môi trường lên men tốt nhất.