Vói mục đích tìm kiếm được các chất có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng được sử dụng làm thuốc. Chúng tôi đã tiến hành thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được.
Với 8 mẫu tổng hợp được chúng tôi gửi tới Phòng Sinh học thực nghiệm
Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên (Viện KH & CN Việt Nam) tiến hành thử tác dụng sinh học theo phương pháp hiện đại nhằm thu được kết quả chính xác, khách quan.
2,4.1. Nguyên tắc thử
Nguyên tắc của phép thử như sau:
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên phiến vi lượng 96 giếng của chất tổng hợp theo phương pháp hiện đại của Vanden bergher và Vlietlnck (1994) theo 2 bước :
+ Bướcl: sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính
+ Bước2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu(MIC) của chất có hoạt tính. + Kháng sinh kiểm định bao gồm Ampicilin, đối với vi khuẩn
Gr(+), Tetracycline đối vi khuẩn Gr(-), Nystatin đối vơi nấm sợi và nấm men.
+ Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
VK Gr(-) : Escherichia coli (ATCC 25922);
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25932);
VK G r(+): Bacillus subtllisịATCC 27212);
Staphylocccus aureus
Nấm sợi; Aspergillus niger ;
Fusarium oxysporum.
Nấm men: Candida ablicans;
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Sabouraud dextrose broth và Trypcase soya broth (TBS). Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm).
Mẫu thử nghiêm được hoà tan trong DMSO; với 4-10 thang nồng độ được pha loãng từ dung dịch gốc rồi nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng. Vi sinh vật kiểm định sau khi được hoạt hoá được pha loãng bằng môi trường dinh dưỡng cho tới nồng độ tương đương 0,5đv Meland (khoảng 10*vsv/ml). Để tủ
ấm 37°c/24h đối với vi khuẩn và 30°c/48h đối với nấm. Sau đó đọc kết quả và
tính giá trị ức chế tối thiểu (MIC).
Mẫu thô có MIC < 200 ịxg/ml; Mẫu tinh có MIC ^ 50 |Lig/ml là có hoạt
tính.
2.4.2. Các bước tiến hành.
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính.
+ Chuẩn bị vi sinh vật.
Nấm và vi khuẩn được duy trì trong môi trường dinh dưỡng: Sabouraud dextrose broth và Trypcase soya broth. Các chủng kiểm định được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể (24h đối vói vi khuẩn, 48h đối với nấm).
+ Chuẩn bị mẫu thử.
Hòa tan các chất trong dung dịch DMSO 100% bằng máy Vortex vói nồng độ 4mg/ml.
Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến vi lượng 96 giếng.
Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn dung dịch vsv đã hoạt hoá. + Chuẩn bị đối chứng dưoỉng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dãy 1: Môi trường.
Dãy 2: Kháng sinh Ampicilin + vi khuẩn Gr(+) kiểm định (ampicilin được pha trong dung dịch DMSO 100% ở nồng độ 0,4 nm/ml).
Dãy 3: Kháng sinh tetracylin + vi khuẩn Gr(-) kiểm định (tetracylin được
pha trong DMSO ở nồng độ 0,4( nm/ml).
+ Qiuẩn bị đối chứng âm Chỉ có vi sinh vật kiểm định. + Đọc kết quả:
Mẫu dưoỉng tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt không có vi sinh vật kiểm định phát triển giống như hình ảnh ở các giếng chứng dương.
Mẫu dương tính ở bước một sẽ được tiếp tục thử ở bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2 : Tìm nồng độ ức chế tối thiểu của chất cố hoạt tính.
Các buớc tiến hành như bước 1; riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần từ 4 - 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Đọc kết quả:
Nồng độ dương tính là nồng độ ở đó không có vi sinh vật phát triển mẫu
thô có MIC <200|j,g/ml; mẫu tinh có MIC <50Ịj,g/ml là có hoạt tính.
2.4.3. Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm.
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩi^của các chất tổng hợp được ghi ở
, , „ Ậ h a n q n a m
Nồng độ ức chế tối thiểu ( MIC :|a,g/ml ) Chất
Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
E.coli p.aerugỉnosa B.subtilỉs S.aureus A.nỉger E.oxysporum Sac.cerevỉsỉae C.albỉcạns
II (-) 50 (“) 12,5 12,5 50 50 III 25 50 í") 12,5 25 25 25 IV 25 50 (") (“) 12,5 25 25 25 V (-) 50 12,5 12,5 25 (-) VI (-) 25 (-) (-) (-) (-) VII (-) 25 í“) 50 50 50 50 VIII (-) 50 50 (”) 50 50 50 50
Sau khi tiến hành thử tác dụng kháng khuẩn của 8 chất tổng hợp đươc tại Phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên(Viện KH & CN Việt Nam trên 4 chủng vi khuẩn chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
Chất II chỉ có tác dụng kháng p.aeruginosa (MIC=50 |xg/ml) mà không có tác dụng kháng 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm còn lại,
Chất III, IV có tác dụng kháng 2 vi khuẩn Grị-) là E.coli, và
p.aeruginosa fMIC=25- 50 ỊLig/ml), không có tác dụng kháng vi khuẩn Gr(+).
Chất V, VI, VIII chỉ có tác dụng kháng vi khuẩn p.aeruginosa fMIC=25-
50 fxg/ml, không có tác dụng kháng 3 chủng vi khuẩn thử nghiệm còn lại.
Chất VIII kháng 2 vi khuẩn là p.aeruginosa, và Bacillus subtilis
(MIC=50 |j,g/ml), không có tác dụng với 2 chủng còn lại.
Sau khi tiến hành thử tác dụng kháng nấm của 8 chất tổng hợp được tại Phòng Sinh học thực nghiệm-Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên(Viện KH & CN Việt Nam trên 4 chủng vi nấm chúng tôi rút ra nhận xét như sau:
Ba chất II, III, IV có tác dụng kháng 4 chủng nấm đem thử vói nồng độ tối thiểu là MIC = 12,5 - 50 |ig/ml.
Chất V: có tác dụng kháng 3 chủng Sac.cerevisiae, F.oxysporum A.niger (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
MIC = 12,5 - 50 fj.g/ml. Không có tác dụng kháng Candida albicans.
Chất VI: không có tác dụng kháng nấm.
Hai chất VII, VIII: có tác dụng kháng cả 4 chủng nấm vód MIC = 50|j,g/ml.
2.5. BÀN LUẬN
2.5.1. Về tổng hợp hoá học.
Chúng tôi đã áp dụng phản ứng Sandmayer (1919) để tổng hợp 5- methylisatin đi từ p-toluidin. So vói công trình đã công bố gần đây về tổng hợp 5-methylisatin [32] thì chúng tôi đạt hiệu suất cao hơn về tổng hợp chất trung
gian p-methylisonitrosoacetapiilid (80% so với 68%) vì đã cải tiến điều kiện
phản ứng là dùng lượng acid hỵdrocloric đặc lớn hofn và lượng nước lớn hơn để hoà tan p-toluidin vì thế phản ứng tạo p-methylisonitrosoacetanilid thuận lợi và do đó hiệu xuất tăng rõ rệt. Phản ứngđóng vòng tạo 5-methylisatin chúng tôi đạt hiệu suất tương tự tài liệu [32] ( 86%).
Phản ứng ngưng tụ isatin và 5-methylisatin với thiazolidin-2,4-dion trong dung môi acid acetic, với xúc tác natri acetat khan đạt được hiệu suất khá cao (75,2% và 62,8%)
Phản ứng Mannich đối vói các chất III và IV xảy ra tương đối dễ dàng ở nhiệt độ phòng vói thòi gian 2 giờ đã tạo ra các dẫn chất base diMannich (V - VIII), Kết quả này phù hợp với công trình nghiên cứu dẫn chất base diMannich của chất (III) [32].
2.5.2. Vê xác định cấu trúc.
Các kết quả phân tích phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ khối lượng đã cho phép chúng tôi kết luận cấu trúc các chất tổng hợp đúng như dự kiến, đặc biệt phổ hồng ngoại và phổ khối lượng đã xác định rõ cấu trúc của sản phẩm ngưng tụ và các dẫn chất base diMannich dự kiến tổng hợp.
2.5.3. Về hoạt tính kháng khuẩn.
Từ kết quả đã nêu ở bảng ^ cho thấy 7 dẫn chất isatin tổng hợp được đều
có hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa (MIC=25-50/ml) ngoài ra 2 dẫn
chất base diMannich (VII, vni) có hoạt tính kháng E.coỉi khá mạnh
kháng 2 vi khuẩn Gr(+) đã thử nghiệm, trừ chất v i n có hoạt tính kháng Bacillus subtilis. Có thể nhận thấy hai chất (HI, IV) có hoạt tính kháng cả 2 chủng vi
khuẩn Gr(-), điều này cho thấy cấu trúc của hai sản phẩm ngưng tụ của isatin và
5-methylisatin với thiazolidin-2,4-dion là rất đáng chú ý, cần nghiên cứu sâu hofn. Việc gắn các nhóm base diMannich làm mất hoạt tính kháng E. coli và hai
dẫn chất base diMannich (VI, VII) có hoạt tính hoạt tính kháng p.aeruginosa
cao hơn 2 chất (III, IV).
2.5.4. Vê hoạt tính kháng nấm.
1 dẫn chất isatin (II, III, IV, V, vn, VIII) có hoạt tính kháng 4 chủng nấm
thử nghiệm rõ rệt (MIC=12,5-50/ml) còn chất VI không có hoạt tính kháng nấm. Đáng chú ý là 2 chất III, IV có hoạt tính kháng 2 chủng nấm men mạnh hơn các chất còn lại. Điều này nói lên ý nghĩa về cấu trúc 2 sản phẩm ngưng tụ isatin và 5-methylisatin vói thiazolidin-2,4-dion đối với tác dụng kháng nấm. Việc gắn các nhóm base diMannich hầu như làm giảm hoạt tính kháng nấm so vói chất III, IV. Điều này tương tự như ở tác dụng kháng khuẩn.
* Về liên quan cấu trúc - tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các dẫn chất của isatin tổng hợp được, chúng tôi có một vài nhận xét sơ bộ sau đây:
Các dẫn chất ngưng tụ của isatin và 5-methylisatin với thiazolidin-2,4-dion (III,IV) có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm cao hofn các isatin tương ứng, điều này cho thấy vai trò của nhân thiazolidin-2,4-dion và cấu trúc của sản phẩm ngưng tụ.
Các dẫn chất base diMannich (V-VIII) của (ni,IV) đa số có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm kém hai chất III, IV. Có lẽ các nhóm base diMannich làm cho cấu trúc phân tử trở nên cồng kềnh hơn ảnh hưởng đến tính thấm qua màng tế bào, vi khuẩn, vi nấm.
PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
3.1. KẾT LUẬN.
Từ những nghiên cứu trình bày ở trên chúng tôi rút ra một số nhận xét như (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
sau:
1. Chúng tôi đã tổng hợp được 8 chất gồm : thiazolidin-2,4-dion(I), 5-
methylisatin(II), và 6 dẫn chất của isatin và 5- methylisatin(III-VIII), trong đó
có 3 chất IV, v n , v i n chưa thấy công bố trong các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được.
2. Các phản ứng tổng hợp được theo dõi bằng SKLM để xác định thời gian phản ứng thích hợp .
3. Đã kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được bằng SKLM, và xác nhận cấu trúc bằng phổ hồng ngoại, tử ngoại và khối phổ. Kết quả cho phép chúng tôi kết luận đã tổng hợp được các chất đúng như dự kiến.
4. Đã thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 7 chất tổng hợp được (II-
VIII) vói 4 chủng vi khuẩn (gồm hai chủng Gram(+): Staphylococcus aureus.
Bacillus subtilis, hai chủng Gram(-): Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli), 4 chủng vi nấm (gồm 2 chủng nấm sọi: A. niger, F.oxysporum, và 2 chủng
nấm men: Candida albicans, Sacharomyces cerevisiae. Kết quả cho thấy cả 7
chất có hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa, 2 chất (ni, IV) có tác dụng
kháng Escherichia coỉi, một chất kháng Bacillus subtilỉs (v n i), 5 chất (II, in,
IV, VII, VIII) kháng cả bốn chủng vi nấm, một chất kháng 3 chủng vi nấm (V), một chất (VI) không có hoạt tính.
3.2. ĐỂ XUẤT.
Với các kết quả đã đạt được trong quá trình thực nghiệm chúng tôi hi vọng góp phần nhỏ làm phong phú thêm các nghiên cứu về dãy dẫn chất isatin. Để tiếp tục và phát triển các kết quả đã đạt được chúng tôi có một số đề xuất sau:
+ Cần tiếp tục thử nghiệm sâu hcfn và rộng hofn về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tất cả các chất tổng hợp được đặc biệt là các dẫn chất ngưng tụ
của isatin và 5-methylisatin vói thiazolidin-2,4 -dion (in, IV).
+ Tiến hành tổng hợp các dẫn chất mới của isatin và sàng lọc thử tác dụng sinh học của chất tổng hợp được, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao để hướng tới ứng dụng vào thực tế lâm sàng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ môn Hóa hữu cơ- Trường Đại học Dược Hà Nội (2004) Hoá
học hữu cơ tập 1.
2. Dược điển Việt Nam II (1994), NXB Y học, tập 3 trang 504.
3. Nguyễn Quang Đạt, Bùi kim Liên, (1977), Nghiên cứu tác dụng
chống phân bào, Thông báo khoa học, Đại học Dược Hà Nội; số 27, trang
97-103
4. Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn Xuân thuỷ, Phạm minh Tâm (1981),
Tóm tắt các báo cáo khoa học hội nghị khoa học toàn quốc. Trang 37
5. Nguyễn Quang Đạt, Trần Viết Hùng và cộng sự (1998) Tổng hợp
và thăm dò tác dụng sinh học của một số dẫn chất isatin, Tạp chí Dược học,
số 12, trang 8-10. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Vũ Thị Thu Hà, Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của 7-
cloroisatin và dẫn chất, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 54
7. Nguyễn Thị Bích Hạnh, Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học
của 7-cloroisatin và dẫn chất, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 55.
8. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt (1999) Tổng hợp và thăm dò
tác dụng sinh học củaN-hydroxymethyl-5-bromoisatin và dẫn chất, Tạp chí
Dược học, số 10, trang 4-5..
9. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Nguyễn thị Phượng (1999) , Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-fluoroisatin
và dẫn chất, Tap chi Dược học, số 11, trang 4-5.
10. Trần viết Hùng, Nguyễn quang Đạt, Chu thị Lộc, Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5-fluoroissatin-3-arylimin,
Tạp chí Dược học, số 1, trang 13-14.
11. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Phạm Minh Thuỷ (2000),
Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn của 5-bromo-l-
12. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt và cộng sự (2000) Nghiên cứu tác dụng chống lao của một số dẫn chất thiosemicarbazon và
isonicotinoyl-hydrazon của isatin và 5-halogenoisatin, Tạp chí dược học, số
5,trl5-17.
13. Trần Viết Hùng, Nguyễn Quang Đạt, Phạm Minh Thuỷ, (2000) Tổng hợp và thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất
base Mannich của 5-fluoroissatin và dẫn chất. Tạp chí Dược học, s ố 5, trang
14-16.
14. Trần Thanh Long, Tổng hợp và thăm dò tác dụng sinh học của 5-
Cloroisatin và dẫn chất, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khoá 53
15. Nguyễn Thị Xuân Thuỷ, Nguyễn Khang, Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải. Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich của
Nitrofurfurantoin và thăm dò tác dụng dược lý, Tạp chí dược học 1993, số 2,
trl4-16.
16. Nguyên Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng
trong hóa học, NXB Đại học quốc gia Hà Nội, tập 1
17. Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lý và
hoá lý, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội, tập 1.
18. Bauer-BritJ. Pharmacol (1960),p.5101; The Merk index
(1989),ir''ed,ỹ.9A3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19. N.H.Eshba anh N.M.SlaLaMa (1985), 5-(2-oxo—indolinyldene)
thiazolidin-2,4-dion-l,3-di-Mannich.Base Derivatives: Syeithesin and
Evalutation for Antileukemic Activity, Pharmazie 40, (320-332).
20. T.A.Foglia, D.Swem (1968), Reaction of N, N-diclorouretan with
indol and derivatives, J. Org. Chem, vol 33,p .4440-4442.
21. B.A. Grinberg, B. Mmazylis (1990), isatin and related compounds:
potential monoaminooxydase inhibitor, Chemija, 2, p. 87-92; CA 1991, vol
22. K. C. Josi and P.Chand (1982), Biologically active indole
derivatives, Die Pharmazie, 37 (1, p.1-12).
23. K.C. Josi,. Pathak, S. K.. Jain (1980), Synthesis and antibacterial
fungicidai and antiviral of some new isatin derivatives, Indian. J.
Chern.soc.mO, 57 (12), p. 1176-1180; CA 1981, vol 95, 43046y.
24. C.S. Marvei, G.S. Hiers (1956), Organic synthesis, Collective, voll
p.327-330.
25. J.March (1968), Advanced organic chemistry; reactin,
mechanisms and structure M® Graw, Hill book company, N.Y. Toronto,
London, 1968.
26. E. Mameli., L.Zorgi (1954). Amidine derivatives of thiazolidine. II
Farmco (Pavia)..9, 691-70 , C.A vol 49(1955), 6229b.
27. D. Maysinger, M. Movrin, M.M. Saric (1980), Structural anaogues
of isati and their antimicrobial activity. Die Pharmazie, 35(1) ,p.l4-16.
28. M.S. Pani, M.V .Reddy (1994) , isatin [N-(2-aikylbenzosazole-5-
carbonyl)]hydrazol, Indian J.Pharm. Sei; 56(5), 174-7, CA 1995, vlol23,
143699d.
29. F.D. Pop (1969), Synthesis of potential antineoplastic agents, J.
Med. Chem, 12(5), p. 182.
30. P.W. Sadler (1969), Antiviral chemotherapy with isatin beta-
thiosemicarbazon , CA., vol 55, 11432c.
31. R.M. Silverstein, G.C. Bassler, J.C Morrill (1981), Spectrometric
indentification of organic compounds, 4*ed- Jonh Wiley, New york 1981. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
32. L.F.Tietze, Th.Eicher (1991), Reaktionen und Synthesen, Georg
Thieme Verlag Stuttgart-New york (358
33. L.S. Skochimora, A. Hadama (1954), The tuberculostatic activity
of some isatin derivatives, J. Phar.Soc. Japan, 74, p. 419-422; CA 1955, vol,
34. R.S. Varma, W.L. Nobeles (1967), Synthesis and antiviral of
certain N-dialkylaminomethyl isatin beta- thiosemicarbazon, J. Med. Chem
. (1967), Vol 10, p. 972-973.
35. R.S. Varma, W.L. Nobles (1975), Antiviral and antifungal
PHỤ LỤC
Phụ lục 1.1 - 1.8. Phổ hồng ngoại của các chất I - VIII.
Phụ lục 2 .1 - 2.8. Phổ tử ngoại của các chất I - VIII.