Phổ khối lượng phun mự điện tử (Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trờn mỏy AGILENT 1200 LC-MSD Trap của Viện Hoỏ học cỏc Hợp chất Thiờn nhiờn, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhõn (NMR): 1H-NMR (500MHz) và 13C- NMR (125MHz) được đo trờn mỏy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Húa học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.3.4. Độ quay cực [α]D.
Độ quay cực được đo trờn mỏy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hoỏ học - Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
2.4 Dụng cụ và thiết bị
2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết
Các dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết và tinh chế chất sạch được sử dụng bao gồm:
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 35
- Micropipet.
- Máy cô quay chân không.
- Đèn tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 368 nm. - Tủ sấy chân không.
- Máy sấy, bếp điện
- Bình sắc ký loại phân tích và điều chế. - Cột sắc ký pha thường các loại đường kính. - Cột sắc ký pha ngược trung áp.
- Máy phun dung dịch thuốc thử.
2.4.2. Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc.
-Máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT-NMR spectrometer.
- Máy sắc ký lỏng cao áp ghép nối phổ (ESI) AGILENT 1200 LC-MSD Trap spectrometer.
- Thiết bị đo điểm nóng chảy Kofler micro-hotstagẹ - Thiết bị đo độ quay cực JASCO
2.5 Hoá chất.
- Silicagel 60 (0,04-0,063mm) Merck.
- Silicagel pha đảo ODS hoặc YMS (30-50 m, Fujisilica Chemical Ltd.)
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 36
- Bản mỏng tráng sẵn pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715).
- Bản mỏng tráng sẵn pha ngược RP18 F254s (Merck).
- Bản mỏng điều chế pha thường DC-Alufolien 60 F254 (Merck).
- Các loại dung môi hữu cơ như methanol, etanol, ethyl acetate, chlorofrom, hexane, acetone, v.v... là loại hoá chất tinh khiết của Merck. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.6. Chiết phân đoạn và phân lập các hợp chất 2.6.1. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu 2.6.1. Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu
Phần trên mặt đất của M. glabriusculus (2,0 kg) được chiết ba lần với MeOH bằng máy siêu âm Ultrasonic 2010 ở nhiệt độ 40-50 oC trong vòng 20 phút. Dịch chiết sau đó được cô đặc bằng máy cất quay với áp suất giảm để thu được 35 g cặn chiết MeOH.
2.6.2.Phân lập các hợp chất
Cặn MeOH được hòa vào nước và phân lớp với CHCl3 và etyl axetat để thu được các dịch cô CHCl3 (ký hiệu là MGC, 15 g), etyl axetat (ký hiệu là MGE, 8 g) và dịch cô nước (Ký hiệu là MGN, 10,5 g).Phân đoạn etyl axetat được phân tách thô bằng sắc ký cột silica gel pha thường thành rửa giải gradient cloroform/metanol 50/1-1/1 thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn ký hiệu là MGE1 - MGE5.
Tiếp tục tinh chế phân đoạn MGE2 bằng sắc ký cột silicagel pha thường rửa giải bằng hệ dung môi cloroform/axeton 3/1 thu được hợp chất 1 (MGE3B, 23 mg) dưới dạng tinh thể hình kim màu vàng. Tương tự, hợp chất 2 (MGE2D, 30mg) được tinh chế từ phân đoạn MGE5 bằng sắc ký cột silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải MeOH/H2O 4/1.
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 37
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Chiết cánh Mallotus glabriusculus
Cặn cloroform (5 g)
Bột lỏ khô ( 2 kg )
Chiết MeOH
Cặn MeOH 15 (g) Bổ sung nước cloroform: nước 1/1
etyl axetat: nước 1/1
Cặn EtOAc (20 g) Lớp nước
Bổ sung etyl axetat Lớp nước
Lớp nước
- sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel;
MGE1 MGE2 MGE3 MGE4 MGE5
MGE3B - Silica gel CC - clorofoc/axeton (3/1, v/v) MGE2D - YMC RP-18 CC - metanol/nước (4/1, v/v)
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 38
CHƯƠNG 3: KếT QUả Và THẢO LUẬN
3.1. Hằng số vật lớ và dữ kiện phổ của cỏc hợp chất. 3.1.1. Hợp chất 1 (MGE3B )
Tinh thể hình kim màu vàng chanh, điểm nóng chảy: 269-271oC, độ quay cực []26
D: 62 (c, 0,28 in MeOH), ESI-MS m/z 595 [M+H]+, 617 [M+Na]+ ( positive) và 593 [M-H]- (negative), công thức phân tử C30H26O13 (M = 594). 1H-NMR (500MHz, CD3OD) δ: 6,11 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,31 (d, J = 2,0 Hz, H-8), 8,00 (d, J = 8,5 Hz, H-2, H-6), 6,83 (d, J = 8,5 Hz, H-3, H- 5), 5,25 (d, J = 8,0 Hz, H-1), 3,47-3,52 (m, H-2, H-3, H-4), 3,35 (m, H- 5), 4,20 (đ, J = 5,0, 11,5 Hz, Ha-6), 4,32 (đ, J = 2,0, 11,5 Hz, Hb-6), 6,09 (d, J = 16,0 Hz, H-2), 7,42 (d, J = 16,0 Hz, H-3), 7,31 (d, J = 8,5 Hz, H-5, H-9) và 6,80 (d, J = 8,5 Hz, H-6, H-8). 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 159,35 (C-2), 135,22 (C-3), 179,41 (C-4), 162,94 (C-5), 99,97 (C-6), 165,87 (C-7), 94,83 (C-8), 158,39 (C-9), 105,62 (C-10), 122,74 (C-1), 132,19 (C-2, C-6), 116,05 (C-3, C-5), 161,49 (C-4), 104,80 (C-1), 78,02 (C-2), 75,73 (C-3), 71,73 (C-4), 75,80 (C-5), 64,33 (C-6), 168,79 (C-1), 114,77 (C-2), 146,53 (C-3), 127,11 (C-4), 131,15 (C-5, C-9), 116,78 (C-6, C-8) và 131,14 (C- 7). 3.1.2. Hợp chất 2( MGE2D)
Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy: 238-2420C, ESI-MS m/z 486,9 [M+Na]+ (positive) và 462,9 [M-H]- (negative), công thức phân tử C21H20O12 (M= 464).
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6,21 (d, J = 1,5 Hz, H-6), 6,40 (d, J = 1,5 Hz, H-8), 7,84 (d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,87 (d, J = 8,5 Hz, H-5′), 7,58
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 39 (đ, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6′), 5,16 (d, J = 8,0 Hz, H-1′′), 3,64 (m, H-2′′), 3,56 (m, H-3′′), 3,53 (m, H-4′′), 3,47 (m, H-5′′), 3,85 (m, Ha-6′′) và 3,81 (m, Hb- 6′′); 13 C-NMR (125MHz, CD3OD) δ: 157,92 (C-2), 134,61 (C-3), 178,36 (C-4), 161,98 (C-5), 99,25 (C-6), 166,07 (C-7), 93,97 (C-8), 157,55 (C-9), 104,39 (C-10), 122,07 (C-1′), 116,55 (C-2′), 144,92 (C-3′), 148,90 (C-4′), 115,01 (C-5′), 122,18 (C-6′), 103,49 (C-1′′), 74,73 (C-2′′), 77,13 (C-3′′), 70,22 (C-4′′), 77,37 (C-5′′) và 61,57 (C-6′′). 3.2. Thảo luận
3.2.1. Xỏc định cấu trỳc húa học của hợp chất 1 (MGE3B).
Hợp chất 1 nhận được dưới dạng chất tinh thể hình kim có màu vàng. Trên phổ 1H-NMR của 1 xuất hiện bốn tín hiệu doublet của 2 cặp proton H
8,00 (2H, d), 6,83 (2H, d) đôi một ở vị trí octo với nhau bởi hằng số tương tác
J = 8,5 Hz. Chứng tỏ có sự tồn tại của hai vòng thơm đều thế para tạo nên một trục đối xứng. Sự xuất hiện hai tín hiệu doublet tại H 6,11 và 6,31 ppm với hàng số tương tác nhỏ (J = 2,0 Hz) chứng tỏ hai proton này nằm ở vị trí meta
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 40 Hình 3.2.1.ạ Phổ 1H-NMR của 1 O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O OH OH OH O O OH 1''' 2''' 3''' 4'''5''' 6''' 7''' 8''' 9''' Hình 3.2.1.b. Cấu trúc của hợp chất 1
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 41
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 42
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 43
Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của nhóm trans- coumaroyl, 4 cặp proton được xác định thuộc vào vòng thơm có hệ tương tác AÁBB' tại H 7,31, 6,80 (2H, d, J = 8,5 Hz) và 2 proton olefin của một nối đôi dạng trans 6,09 (1H, d, J = 16,0 Hz) và 7,42 (1H, d, J = 16,0 Hz). Sự có mặt của một phân tử đường cũng được xác định bởi sự xuất hiện của proton anome tại H 5,25 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1) và các tín hiệu của proton thuộc phân tử đường nằm trong vùng H 3,35-4,32 ppm. Nhánh phân tử đường được xác định là -glucozơ bởi hằng số tương tác cao của proton cacbon anome (J = 8,0 Hz) cũng như sự xuất hiện của hai proton của nhóm CH2OH tại H 4,32 (2H, đ, J = 2,0, 11,5 Hz, H-6).
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 44 Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của 1 C #Ca,b Ca, b DEPT H a, d (dạng pic, J = Hz) HMBC (H C) Aglycon 2 160,1 159,35 C - 3 136,0 135,22 C - 4 180,1 179,41 C - 5 163,7 162,94 C - 6 101,1 99,97 CH 6,11 (d, 2,0) 5, 7, 8, 10 7 167,6 165,87 C - 8 95,8 94,83 CH 6,31 (d, 2,0) 6, 7, 9, 10 9 159,3 158,39 C - 10 106,2 105,62 C - 1′ 123,6 122,74 C - 2′, 6′ 133,0 132,19 CH 8,00 (d, 8,5) 2, 3′, 4′, 6′ 3′, 5′ 116,8 116,05 CH 6,83 (d, 8,5) 1′, 4′, 5′ 4′ 162,3 161,49 C - glucopyranoside 1′′ 104,9 104,80 CH 5,25 (d, 8,0) 3 2′′ 78,8 78,02 CH 3.47-3.52 3′′ 76,5 75,73 CH 3.47-3.52 4′′ 72,5 71,73 CH 3,35 (m) 5′′ 76,6 75,80 CH 3.47-3.52 6′′ 65,1 64,33 CH2 4,20 (đ, 5,0, 11,5) 4,32 (đ, 2,0, 11,5) 1′′′ 6''-O-trans-p-coumaroyl 1′′′ 169,6 168,79 C -
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 45 2′′′ 115,6 114,77 CH 6,09 (d, 16,0) 3′′′ 147,4 146,53 CH 7,42 (d, 16,0) 4′′′ 127,9 127,11 C - 5′′′, 9′′′ 132,0 131,15 CH 7,31 (d, 8,5) 6′′′, 8′′′ 117,6 116,78 CH 6,80 (d, 8,5) 7′′′ 162,0 131,14 C -
ađo trong CD3OD, b125 MHz, c400 MHz, d500 MHz. #C của tiliroside []
Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của 1 xuất hiện tín hiệu của 30 cacbon trong đó các tín hiệu của hai cacbon cacbonyl ( 168,79 và 179,41), 12 cacbon bậc bốn, 13 nhóm metyl và 1 nhóm oximetylen, trong đó có 6 cacbon thuộc vào một phân tử đường glucose (104,80, 78,02, 75,73, 71,73, 75,80 và 64,33 ppm). Để xác định vị trí của gốc trans-coumaroyl và đơn vị đường trên khung flavon, chúng tôi đã tiến hành đo phổ HSQC, HMBC. Tương tác HMBC từ proton anome H-1 δH 5,25 (1H, d, J = 8,0 Hz) với cacbon C-3 ( 135,22) khẳng định vị trí liên kết của đơn vị đường tại C-3. Vị trí liên kết của gốc
trans-coumaroyl tại C-6 của đường glucose được xác định bởi tương tác HMBC giữa các proton H-6 ( 3,20 và 3,42) và cacbon C-1 ( 168,79).
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 46 Hình 3.2.1.f Phổ HMBC của 1 O O O OH HO OH O OH OH OH O O OH Hình 3.2.1.g Một số tương tác HMBC chính của 1
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 47
Hình 3.2.1.h Phổ ESI-MS nagative của hợp chất 1
Trên phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS của 1 xuất hiện píc có cường độ cao tại m/z 595 [M+H]+, 617 [M+Na]+ ở chế độ positive và m/z 593 [M-H]- ở chế độ negative tương ứng với công thức dự đoán là C30H26O13 (M = 594). Phổ ESI-MS bẫy và bắn mảnh m/z 595 ở positive cho phân mảnh có cường độ cao ở m/z 287 [M+H-coumaroyl]+, bẫy và bắn mảnh m/z 463 ở negative cho phân mảnh có cường độ cao ở m/z 285 [M-H-coumaroyl]- gợi ý cho sự mất một phân tử đường rhamnose và nhóm coumaroyl. Từ các dữ kiện phổ trên, cùng với sự phù hợp về số liệu phổ NMR của 1 so với các số liệu tương ứng đã được công bố trong tài liệu tham khảo [1] có thể khẳng định được hợp chất 1 là kaempferol-3--D-(6-O-trans-p-coumaroyl)-gluco- pyranoside hay còn được gọi là tilirosidẹ Hợp chất này đã được phân lập từ loài Tilia spp và một số loài khác như Eremocarpus setigerus, Fragaria ananass, Solanum erianthum... Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ loài Mallotus glabriusculus.
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 48
3.2.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (MGE2D)
Hợp chất 2 thu được ở dạng bột màu vàng cam. Trên phổ 1H-NMR của 2
xuất hiện các tín hiệu của 5 proton vòng thơm trong đó hai proton được xác định ở vị trí meta với nhau ( 6,21 và 6,40 ppm, J = 1,5 Hz) và 3 proton còn lại được xác định thuộc vào một vòng thơm có hệ tương tác ABX [ 7,84 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,87 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,58 (1H, đ, J = 2,0, 8,5 Hz)]. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện một tín hiệu của proton anome [ 5,16 (1H, d, J = 8,0 Hz)] và các tín hiệu proton của vùng đường [ 3,85 (1H, m), 3,81 (1H, m), 3,64 (1H, m), 3,56 (1H, m), 3,53 (1H, m) và 3,47 (1H, m)] gợi ý sự xuất hiện của một phân tử đường -D-glucosẹ
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 49 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 C #δC δCa,b δH a,c (dạng pic, J = Hz) 2 159,2 157,92 3 135,8 134,61 4 179,6 178,36 5 163,2 161,98 6 100,1 99,25 6,21 (d, 1,5) 7 166,3 166,07 8 94,9 93,97 6,40 (d, 1,5) 9 158,6 157,55 10 105,8 104,39 1′ 123,2 122,07 2′ 117,7 116,55 7,84 (d, 2,0) 3′ 146,1 144,92 4′ 150,0 148,90 5′ 116,1 115,01 6,87 (d, 8,5) 6′ 123,3 122,18 7,58 (đ, 2,0, 8,5) Glucopyranoside 1′′ 104,5 103,49 5,16 (d, 8,0) 2′′ 75,9 74,73 3,64 (m) 3′′ 78,3 77,13 3,56 (m) 4′′ 71,4 70,22 3,53 (m) 5′′ 78,5 77,37 3,47 (m) 6′′ 62,7 61,57 3,85 (m) 3,81 (m)
ađo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz, #δC của isoquercitrin [2]
Trên phổ 13C-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 22 cacbon trong đó các tín hiệu của một cacbon cacbonyl (178,36) và 6 cacbon thuộc vào một phân tử đường glucose ( 103,49, 77,37, 77,13, 74,73, 70,22 và 61,57 ppm).
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 50 O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O OH OH OH OH OH Hình 3.2.2.b. Cấu trúc của hợp chất 2. Hình 3.2.2.c. Phổ 13C-NMR của 2.
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 51
Hình 3.2.2.d. Phổ ESI-MS của 2.
Công thức phân tử của 2 được xác định là C21H20O12 bởi sự xuất hiện của píc 486,9 [M+Na]+ và m/z 462,9 [M-H]- trên phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS). Từ những dẫn chứng trên cùng với sự so sánh dữ liệu phổ NMR giữa hợp chất với hợp chất quercetin-3-O--D-glucopyranoside cho thấy sự phù hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí tương ứng. Do đó có thể khẳng định hợp chất 2 là quercetin-3-O--D-glucopyranosidẹ
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 52
Kết luận
1. Đã thu thập mẫu lượng lớn cây chiết cánh và loài cây được các chuyên gia thực vật học tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật xác định là Mallotus glabriusculus (Kurz) Pax et Hoffm thuộc họ Thầu dầu - Euphorbiaceae. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp, 2 hợp chất đã được phân lập từ phân đoạn chiết etyl axetat của lá cây chiết cánh đó là:
- Tiliroside - Isoquercitrin
3. Cấu trúc của các hợp chất này được xác định nhờ vào các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT 135 và DEPT 90), hai chiều (HSQC và HMBC), Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS).
Cấu trúc hoá học của (1) và (2)
O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O OH OH OH O O OH 1''' 2''' 3''' 4'''5''' 6''' 7''' 8''' 9''' Tiliroside (1) O O O OH HO OH 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1" 2" 3" 4" 5" 6" O OH OH OH OH OH Isoquercitrin (2)
Khúa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2
Nguyễn Thị Hồng Nhị K33C - Khoa Húa học 53
Tài liệu tham khảo
Tài liệu Tiếng Việt
1. Phạm Hoàng Hộ, (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, tập II, trang 251.
2. Võ Văn Chi, (1999), Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, trang 186-231.
3. Châu Văn Minh, Phan Văn Kiệm, Lã Đình Mỡi, Phạm Quốc Long, Nguyễn Thị Kim Thanh, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Chi Mallotus- Hoá học, hoạt tính sinh học và sắc ký Fingerprint ,Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ, trang 141- 155, (2009).
Tài liệu Tiếng Anh
4. Agrawal P. K., (1989), Carbon - 13 NMR of flavonoids.
5. Harborn J. B., (1994), The flavonoids advance in research since 1986,
Chapman & Hall.
6. Mabry F. J., Markman R. B., Thomas M.B., (1970), The sysrematic
identification of flavonoids, Springer Verlag - Berlin - Heidelberg - New
York.
7. Ternai B., Markham K. R., (1976), C13 - NMR of flavonoids -I-
Flavones and flavonols, Tetrehedron, Vol. 32, 565.