- Nguyên liệu:
+ Sử dụng cắn c thu được từ phân đoạn EtOAc để tiến hành phân lập. + Chất nhồi cột là Silicagel cỡ hạt 0,015 - 0,04 um. Nhồi cột theo phưong pháp nhồi cột ướt.
+ Dung môi rửa giải: n- Hexan : EtOAc với những tỷ lệ thích hợp.
- Chuẩn bị cột: Cột thuỷ tinh có khoá và nắp đậy kín, đường kính 1,8 cm,
chiều dài 40 cm, rửa sạch, sấy khô, tráng cột bằng hệ dumg môi n- Hexan : EtOAc (8:2). Dưới đáy cột lót một lớp bông mỏng. Đổ Silicagel vào cột, vừa đổ vừạ gõ nhẹ. Rửa sạch thành cột bằng hệ dung môi nói trên. Sau đó dùng bơm nén cột cho tới khi chiều cao của Silicagel trong cột không thay đổi. Quá trình ổn định cột được hoàn tất
- Tiên hành sãc kỷ :
Hoà tan 0,17 g cắn c bằng 1 lượng tối thiểu EtOAc rồi đưa lên cột. Rửa giải bằng hệ dung môi n- Hexan : EtOAc (8:2), tốc độ rửa giải 20 giọt/phút.
Sau khi chạy hết 60 ml đầu tiên, hứng dịch rửa giải vào các ống nghiệm nhỏ đã đánh số, mỗi ống khoảng 1,5 đến 2 ml. Quá trình thay đổi tỷ lệ dung môi được tóm tắt như sau:
+ Từ ống 1 đến ống 78 dung môi n- Hexan ; EtOAc (8:2) 120 ml + Từ ống 79 đến ống 147 dung môi n- Hexan : EtOAc (7:3) 140 ml + Từ ống 148 đến ống 226 dung môi n- Hexan : EtOAc (6:4) 140 ml + Từ ống 227 đến óng 254 dung môi n- Hexan ; EtOAc (5:5) 60 ml
Kiểm tra các ống hứng được bằng SKLM với hệ dung môi II: Toluen : Ethylacetat: Acid formic (5 :4 :1). Quan sát các bản sắc ký ở ánh sáng thường, ư v 254 và 365 nm, phun ứiuốc thử hiện màu Vanilin 5%/H2S0 4
rồi hơ nóng ở nhiệt độ 110°c ứong 1 - 2 phút. Kết quả thể hiện ở hình 2.8.
ỷ l ị
« I
'" M
ƯV 365 nm Phun thuốc thử
Hình 2.8. Sắc ký đồ ở hệ dung môi II
- Kết quả:
+ Từ ống 3 frở đi xuất hiện vết Clorofin. Các vết Clorofin tiếp tục xuất hiện ở tất cả các ống đã hứng được.
+ Từ ống 150 đến ống 185, dưới u v 365nm cho 1 vết cùng Rf, có màu xanh sáng (đặt tên là vết G l). Các vết này trùng vị trí nhưng khác màu sắc với 1 vết của cắn EtOAc toàn phần. Quan sát các bản sắc ký sau khi đã phun thuốc thử, thấy các vết cùng R f ở các ống nghiệm có màu tím hoa cà, trong khi màu của vết tương ứng ở cắn EtOAc toàn phần lại cho màu vàng nâu. Gộp các ống từ 150 đến 185.
Quy trình tiến hành sắc ký cột được lặp lại như trên với hệ dung môi rửa giải Cloroform, sau đó ứiêm từ 0,1 đến 0,5 % MeOH, kết quả giống như quá trình sử dụng dung môi n-Hexan, các chất trong phân đoạn EtOAc vẫn không tách được.
- Nhận xét: Việc sử dụng Silicagel làm chất mang trên cột sắc ký để tách các
nhiều hệ dung môi với độ phân cực khác nhau như Chloroform, n-Hexan, EtOAc và MeOH. Chúng tôi tạm thời kết luận rằng những chất trong phân đoạn EtOAc là những chất phân cực nên khi sử dụng silicagel là không phù hợp để tách. Do đó nên thay thế chất nhồi cột Silicagel bằng Sephadex LHio-