L ời mở đầu
3.2.2.1.Phân lập
AA01 và AA02
Trong khi lắc cao Hexan thì thấy xuất hiện lớp huyền phù màu vàng tách lớp nằm giữa cao EtOH và dịch n-Hexan, đem lọc và rửa bằng n-Hexan. Đặt tên là phân đoạn V. Ta tiến hành cô lập AA01 và AA02 từ phân đoạn V.
Bước 1: Tiến hành sắc kí cột trung áp đẳng dòng phân đoạn V. Khối lượng mẫu: 427,6 mg
Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút
Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH (70:30) Kết quả thu được 7 phân đoạn.
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
VA CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết dơ VB CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết VC CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết dài VD CHCl3 – MeOH = 70:30 Vết vàng dơ VE CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết VF CHCl3 – MeOH = 70:30 Nhiều vết kéo dài VG CHCl3 – MeOH = 70:30 Có 3 vết tròn
--43--
Bảng 2: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG
Bảng 3: Kết quả cột trung áp phân đoạn VG4
Bước 2: Từ phân đoạn VG tiếp tục tiến hành sắc kí trung áp đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 95 mg
Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút
Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5) Kết quả thu được 5 phân đoạn.
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
VG1 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Vết dơ VG2 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Nhiều vết VG3 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 2 vết vàng
VG4 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 1 vết vàng 1 vết đen
VG5 CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 1 vết đen mờ
Bước 3: Từ phân đoạn VG4 tiếp tục tiến hành sắc kí cột trung áp đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 25 mg
Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút
Hệ dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5) Kết quả thu được 5 phân đoạn.
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
VG4a CHCl3 – MeOH – H2O = 70:30:5 Vết dơ VG4b CHCl3 – MeOH – H2O =
70:30:5 1 vết vàng AA01
VG4c CHCl3 – MeOH – H2O =
70:30:5 1 vết đen AA02
Bảng 4: Điều kiện chạy P-HPLC cao EtOAc
Bảng 5: Kết quả chạy P-HPLC cao EtOAc AA03
Bước 1: Từ cao EtOAc (17g) tiến hành 2 lần sắc kí cột điều chế với hệ dung môi tăng dần.
Khối lượng cao: 14g
Kích thước cột: 40 x 300 (mm) Tốc độ dòng: 20 ml/phút
Dung môi A: n-Hexan, B: EtOAc, C: MeOH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước Thời gian (phút) Tốc độ (ml/phút) %A %B %C
1 5 20 100 0 0 2 20 20 100 0 0 3 100 20 0 100 0 4 20 20 0 100 0 5 15 20 0 85 15 6 10 20 0 85 15 7 10 20 0 0 100
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
EA Hexan = 100% Nhiều vết
EB Hexan – EtOAc =75:25 1 vết tím
EC Hexan – EtOAc =75:25 Nhiều vết
ED Hexan –EtOAc =50:50 Có vết cam
EE EtOAc = 100% Nhiều vết
EF EtOAc – MeOH = 85:15 Nhiều vết
EG EtOAc – MeOH = 80:20 Nhiều vết
EH EtOAc – MeOH – H2O = 70:30:5 Nhiều vết EI EtOAc – MeOH – H2O = 60:40:10 Nhiều vết
--45--
Bước 2: Từ phân đoạn ED ta tiến hành 2 lần sắc kí cột điều chế pha đảo tách diệp lục với hệ dung môi tăng dần từ MeOH – H2O (70:30) đến MeOH – H2O (100:0).
Khối lượng mẫu: 832,9mg Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút
Dung môi: MeOH – H2O
Bước 3: Sau khi tách diệp lục, phần còn lại có vết cam đem chạy sắc kí cột trung áp đẳng dòng.
Khối lượng mẫu: 590,3mg Kích thước cột: 15 x 400 (mm) Tốc độ dòng: 5 ml/phút
Dung môi: CHCl3 – MeOH (99:1)
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
ED1 CHCl3 –MeOH = 99:1 Có vết cam
ED2 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED3 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED4 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED5 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED6 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết ED7 CHCl3 – MeOH = 99:1 Nhiều vết
Bước 4: Từ phân đoạn ED1 ta tiến hành sắc kí cột trung áp chạy đẳng dòng. Khối lượng mẫu: 355,5mg
Kích thước cột: 15 x 250 (mm) Tốc độ dòng: 2 ml/phút
Dung môi: Hexan – EtOAc (80:20)
Bảng 7: Kết quả cột trung áp phân đoạn ED1
Phân đoạn Hệ dung môi TLC
ED1a Hexan – EtOAc = 80:20 Vết dơ
ED1b Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết ED1c Hexan – EtOAc = 80:20 1 vết cam AA03
ED1d Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết ED1e Hexan – EtOAc = 80:20 Nhiều vết
--47-- Chạy MPLC isocratic. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dung môi: CHCl3 – MeOH (99:1)
EA EB EC ED EE EF EG EH EI
Chạy P-HPLC gradient. Dung môi: Hexan – EtOAc Chạy MPLC isocratic
Dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (60:40:10)
AA01 (5mg)
AA02 (1mg)
Chạy MPLC isocratic Dung môi: CHCl3 – MeOH – H2O (70:30:5)
VG5 (7mg) VG1 (8mg) VG2 (28mg) VG3 (10mg) VG4 (25mg) Sơ đồ 2: Tóm tắt các chất đã phân lập Chạy MPLC isocratic.
Dung môi: CHCl3 – MeOH (70:30)
VA (100mg) VB (70mg) VC (11,5mg) VD (20mg) VE (71,9mg) VF (34mg) VG (95mg) ED1 (355,5mg) ED2 (20,9mg) ED3 (11,3mg) ED4 (46mg) ED5 (17,5mg) ED6 (32,7mg) ED7 (95.2mg) Chạy MPLC isocratic.
Dung môi: Hexan – EtOAc (80:20)
AA03 (3mg) Cao Hexan (54g) Phân đoạn V (427,6mg) Cao MeOH (3,5g) Cao EtOAc (14g) Cao EtOH (276g)
Hình 15: Hình dạng AA01 Hình 16: TLC AA01