Thí nghiệm nhằm xác định thời gian và nhiệt độ ủ thích hợp cho giai đoạn rượu hóa của quá trình lên men. Kết quả được trình bày trong Bảng 6.
Bảng 6. Thời gian và nhiệt độ ủ trong giai đoạn rượu hóa Thời gian
rượu hóa Nhiệt độ rượu hóa pH sau lên men
°Brix Độ rượu ở 20°C (% v/v)
3 ngày Nhiệt độ không kiểm soát 4,74 14,30 8,860
3 ngày Nhiệt độ có kiểm soát (30°C) 4,70 17,50 4,530
4 ngày Nhiệt độ không kiểm soát 4,83 12,00 10,90
4 ngày Nhiệt độ có kiểm soát (30°C) 4,71 16,10 7,160
5 ngày Nhiệt độ không kiểm soát 4,78 12,00 10,98
5 ngày Nhiệt độ có kiểm soát (30°C) 4,66 16,00 8,470
6 ngày Nhiệt độ không kiểm soát 4,82 13,10 11,86
6 ngày Nhiệt độ có kiểm soát (30°C) 4,79 14,60 8,130
*Ghi chú: Giá trị trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại.
Nhiệt độ không kiểm soát: Nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32°C).
Nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men mạnh, chuyển hóa đường thành rượu nhanh, đồng thời ổn định và chịu được những biến đổi của môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, 1998). Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men của nấm men Saccharomyces cerevisiae là 28-32°C (Nguyễn Đức Lượng, 1998) nên nghiệm thức kiểm soát nhiệt độ ở 30°C trên lý thuyết là phù hợp cho sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae.
Phương trình hồi quy giữa độ Brix và độ rượu được xây dựng bằng phần mềm Statgraphics : Y2 = 4,20662 ̶ 0,0568299 x X2; với Y: Độ rượu và X: Độ Brix.
Dựa vào phương trình trên có thể thấy độ rượu và độ Brix có tương quan âm. Điều đó cho thấy các quá trình sinh hóa đang diễn ra bình thường vì nấm men sử dụng đường để tạo thành rượu.
Quá trình phân tích phương sai hai nhân tố nhiệt độ và thời gian đối với độ rượu cho thấy sự tương tác giữa hai nhân tố không ảnh hưởng đến độ rượu thu được. Bước vào giai đoạn này, nhiệt độ và thời gian đồng thời ảnh hưởng đến quá trình sản sinh ethanol. Hình 8 và Hình 9 sau đây lần lượt biểu thị sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ ủ trong giai đoạn rượu hóa.
*Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự giống nhau khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%. Nhiệt độ không kiểm soát: Nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32°C).
Ở giai đoạn rượu hóa, nấm men chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ (Hình 8). Ở nhiệt độ phòng, nấm men phát triển mạnh hơn khi ở 30°C vì nhiệt độ phòng tại thời điểm bố trí thí nghiệm cũng dao động trong khoảng 28-32°C và ở nhiệt độ này,
*Ghi chú: Các giá trị có mẫu tự giống nhau khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê với độ tin cậy 95%.
Hình 9 cho thấy độ rượu thu được sau 6 ngày ủ trung bình là 9,995% v/v. Tuy nhiên kết quả này khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ rượu thu được ở nghiệm thức 5 ngày rượu hóa (9,725% v/v).
Thực tế, với 5 ngày lên men kỵ khí và nhiệt độ ủ không kiểm soát là tối ưu vì rút ngắn được thời gian cho giai đoạn rượu hóa và sử dụng điều kiện nhiệt độ môi trường tự nhiên sẽ tiết kiệm được chi phí cũng như đơn giản hóa cho quy trình thực hiện. Do đó thời gian tối ưu cho quá trình rượu hóa được xác định là 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ môi trường xung quanh (28-32°C).