Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

3.4.1. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Bảng 7. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định từ cành và lá

TT Ký hiệu mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men E. coli P. aeruginos a B. subtillis S. aureus A. niger F. oxysporum S. cerevisia e C. albicans 1 Cành (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 Lá (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-)

Kết quả ở bảng 7 cho thấy cả hai mẫu phân tính đều không có biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định.

Bảng 8. Hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết cành và lá Stt Kí hiệu mẫu Nồng độ mẫu

(g/ml) SC% SC50 (g/ml) Kết quả 1 Chứng (+) 50 74,5  0,2 26,19 Dương tính 2 Chứng (-) - 0,0  0,0 - Âm tính 3 Lá 200 38,21  0,1 - Âm tính 4 Cành 200 21,36  0,1 - Âm tính

Kết quả cũng cho thấy: Các mẫu thử: Lá (Dalbergia tonkinensis), Cành (Dalbergia tonkinensis) không biểu hiện hoạt tính chống oxy hoá trên hệ DPPH.

3.4.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào

Bảng 9. Hoạt tính kháng ung thƣ từ dịch chiết của cành và lá

STT Ký hiệu mẫu Tỷ lệ tế bào sống (%) Kết luận Hep-G2 Lu RD 1 DMSO 100,00,0 100,00,0 100,00,0 Âm tính 2 Chứng (+) 0,80,5 1,20,09 1,10,2 Dương tính 3 Cành 98,40,2 89,70,4 79,50,5 Âm tính 4 Lá 97,60,5 93,50,9 86,30,6 Âm tính

Kết quả ở bảng 9 cho thấy các mẫu thử đều không biểu hiện có hoạt tính gây độc tế bào.

3.5 Phân lập các hợp chất từ loài Sƣa (Dalbergia tonkinensis Prain)

3.5.1 Xây dựng quy trình phân lập các hợp chất

Mẫu cây sưa đã phơi khô, xay nhỏ (1,9 kg) được chiết hồi lưu ba lần với MeOH, dịch chiết được gom lại rồi cô cạn thu được 31 g cặn chiết. Cặn MeOH sau đó được hòa vào nước và chiết phân đoạn bằng CHCl3 thu được 7 g cặn CHCl3. Phần nước còn lại được lọc qua cột trao đổi ion (Dianion

HP20) rồi rửa giải bằng metanol/nước (30/70, 70/30 và 100/0, v/v). Phân đoạn rửa bằng 70% MeOH được chạy qua cột sắc ký silica gel với hệ dung môi CHCl3-MeOH-H2O (30:10:1, v/v/v) thu được hợp chất 1: Genistein màu vàng (250 mg). Cặn chiết CHCl3 được tách thành ba phân đoạn nhỏ (F1-3) bằng cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải CHCl3-Me2CO (2/1, v/v). Hợp chất 2: Lanceolarin (12 mg) và hợp chất 3: 9,10-threo-3-[7-(3,10- dihydroxy-9-hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)-9,10-

dihydrophenanthrenyl]propenal (15 mg) thu được từ phân đoạn F2 và F3 tương ứng bằng sắc ký cột pha thường và pha đảo với hệ dung môi thích hợp (sơ đồ 1 và 2) :

Sơ đồ 1. Chiết phân đoạn và phân lập chất từ cặn chiết nước

Bột khô cây sưa (1,9 kg)

Cặn MeOH (31 g)

- Chiết MeOH

- Loại MeOH dưới áp suất giảm

Cặn clorofooc (7 g)

Cặn nước (24 g)

- Bổ sung 2 lit nước cất - Bổ sung 2 lít clorofooc (chiết 03 lần) Phân đoạn 30% MeOH (15 g) Phân đoạn 70% MeOH (2 g) Phân đoạn 100% MeOH (7 g) - Chạy cột Dianion Hợp chất 1 (250 mg) - Silicagel CC - CHCl3-MeOH-H2O (30:10:1, v/v/v)

Sơ đồ 2. Phân lập các hoạt chất từ cặn chiết clorofooc

3.5.2 Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các chất

 Hợp chất 1. Genistein

Chất rắn màu nâu nhạt, công thức phân tử C15H10O5 (M = 270). Phổ khối lượng ESI-MS m/z: 271 [M+H]+.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) H: 6,22 (1H, br s, H-8), 6,32 (1H, br s, H-6), 6,86 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-3', H-5'), 7,37 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-2', H-6'), 8,00 (1H, br s, H-2); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) C: 182,1 (C-4), 165,7 (C-4'), 163,6 (C-7), 159,5 (C-5), 158,6 (C-9), 154,5 (C-2), 131,2 (C-2',6'), 124,6 (C-1'), 123,2 (C-3), 116,2 (C- 3',5'), 106,2 (C-10), 100,0 (C-6) và 94,7 (C-8). Cặn chiết clorofooc (7 g) F2 (1 g) F1 (4 g) F3 (2 g) - Silica gel CC - CHCl3-Me2CO (2/1, v/v) Hợp chất 2 (12 mg) Hợp chất 3 (15 mg) - YMC CC - Me2CO-H2O (3/1, v/v)

 Hợp chất 2. Lanceolarin

Chất rắn màu nâu nhạt, công thức phân tử C27H30O14 (M = 578). Phổ khối lượng ESI-MS m/z: 579 [M+H]+.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1 H-NMR (CD3OD, 500 MHz) H: aglycone: 3,85 (3H, br s, OMe), 6,56 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,74 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 7.00 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-3', H-5'), 7,50 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-2', H-6'), 8,15 (1H, br s, H-2); Glucose: 5,00 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1''), 3,50 (1H, m, H-2''), 3,69 (1H, m, H-3'), 3,36 (1H, m, H-4''), 3,51 (1H, m, H- 5''), 3,65 (1H, m, Ha-6''), 4,08 (1H, m, Hb-6''); Apiose: 4,99 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-1'''), 3,96 (1H, m, H-2'''), 4,04 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-4a'''), 3,80 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-4b''') và 3,63 (2H, br s, H-5'''); 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) #C: aglycone: 182,4 (C-4), 159,2 (C-4'), 161,5 (C-7), 163,5 (C-5), 157,2 (C-9), 155,4 (C-2), 131,3 (C-2',6'), 124,5 (C-1'), 124,8 (C-3), 115,0 (C-3',5'), 108,1 (C-10), 101,4 (C-6), 96,2 (C-8), 55,8 (OMe); Glucose: 101,8 (C-1''), 74,8 (C- 2''), 78,1 (C-3''), 71,7 (C-4''), 77,3 (C-5''), 69,0 (C-6''); Apiose: 111,2 (C-1'''), 78,3 (C-2'''), 80,4 (C-3'''), 75,1 (C-4''') và 66,0 (C-5''').  Hợp chất 3. 9,10-threo-3-[7-(3,10-dihydroxy-9-hydroxymethyl-2,5- dimethoxy)-9,10-dihydrophenanthrenyl]propenal

Chất rắn màu vàng, công thức phân tử C20H20O6. (M = 356). Phổ khối lượng ESI-MSm/z: 357 [M+H]+ . Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H: 3,67 (1H, m, H-9), 3,89 (3H, s, 2-OMe), 3,93 (3H, s, 5-OMe), 3,97 (2H, m, H-11), 5,64 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-10), 6.60 (1H, dd, J = 7,5, 15,5 Hz, H-2'), 6,89 (1H, br s, H-4), 6,90 (1H, br s, H-1), 7,04 (1H, s, H-6), 7,13 (1H, s, H-8), 7,40 (1H, d, J = 15,5 Hz, H-1') và 9,63 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3'); 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C: 53,0 (C-9), 56,0 (2-OMe), 56,1 (5-OMe), 63,9 (C-11), 88,9 (C-10),

108,7 (C-4), 112,3 (C-6), 118,1 (C-8), 119,4 (C-1), 126,4 (C-2'), 128,1 (C-7), 129,1 (C-8a), 132,2 (C-4a, C-10a), 144,5 (C-5), 145,9 (C-3), 146,7 (C-2), 151,5 (C-4b), 153,0 (C-1') và 193,5 (C-3').

Không thấy tương tác giữa H-2' (H 6,60) với C-7 (C 128,1), giữa H-1' (H 7,40) với C-6 (C 112,3) và C-8 (C 118,1) khẳng định nhóm propenal đính vào vị trí C-7. Ngoài ra trong cấu trúc của 3 còn có hai nhóm metoxi có H 3,89 (2-OMe) và 3,93 (5-OMe) được xác định gắn vào vị trí C-2 (C

146,7) và C-5 (C 144,5) dựa trên tương tác HC quan sát thấy trên phổ HMBC. Ngoài ra, sự xuất hiện pic m/z 357 [M+H]+ trên phổ ESI-MS hoàn toàn phù hợp công thức phân tử là C20H20O6. Kết hợp các dữ kiện này và so sánh với tài liệu tham khảo [16], hợp chất 3 được xác định là 9,10-threo-3-[7- (3,10-dihydroxy-9-hydroxymethyl-2,5-dimethoxy)-9,10

dihydrophenanthrenyl]propenal. Đây là lần đầu tiên khung

KẾT LUẬN

Sưa là loại cây ưa sáng, mọc nhanh, ưa đất tốt, cây mọc rải rác trong rừng, trên đất có tầng dày giàu chất dinh dưỡng, ở độ cao tới 500-600m. Cây phân bố khắp cả nước.Trong tự nhiên ít khi gặp được các cây còn với kích thước lớn. Tỷ lệ tái sinh tự nhiên từ hạt còn thấp.

Kết quả trọng lượng trung bình của quả khô là 0,21 gam; chiều dài trung bình của quả là 6,25 cm; chiều rộng trung bình của quả là 1,87 cm. Qua phân tích dữ liệu về hạt cho thấy, trọng lượng trung bình của hạt là 0,0564 gam; chiều dài trung bình của hạt là 1,03 cm; chiều rộng trung bình của hạt 0,6 cm.

Tỷ lệ sống của cành hom đạt khoảng 43% (đối chứng), 58% (300ppm IAA) và 54,1% (300 ppm). Sau khoảng 1 tháng giâm cành cây ra rễ. Thời gian mọc chồi này gần như không có sự khác biệt giữa các lần lấy mẫu và tuổi cành giâm. Việc xử lý chất kích thích ra rễ IAA và IBA ở nống độ từ 100 đếm 300ppm đã có tác dụng tăng thêm tỷ lệ sống với cành giâm loài Sưa. 7-16 % so với đối chứng

Kết qua việc gieo hạt qua xử lý ngâm nước nóng từ 4 giờ cho tỷ lệ nẩy mầm đạt tỷ lệ tương ứng là (87%,79% và 57%) trên đất ở bầu, đất luống phù sa và đất trên khay nhựa; tỷ lệ này là cao hơn so với tỷ lệ nẩy mầm mà hạt được xử lý từ 8 hay 12 giờ. Thời gian nẩy mầm kéo dài từ 9 ngày đến 15 ngày. Thời gian ra lá thật của cây khoảng 20 ngày.

Sau khi gieo 2 tháng cây gieo trên đất phù sa đạt 7,5cm, sau 4 tháng 15,4cm, sau 6 tháng 23,3cm, sau 8 tháng 32,5cm, sau 10 tháng cây cao 43,2cm, sau 12 tháng cây cao 54,2 cm.

Các dịch chiết thô bằng metanol từ cành và lá loài Sưa khi thử hoạt tính vi sinh vât kiểm định, chống oxyhoas và gây độc tế bào đều chưa phát hiện thấy hoạt tính.

Đã xây dựng qui trình phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ loài Sưa. Một số hợp chất chính trong loài Sưa đã được xác

định như Ginestein;lanceolarin;9,10-threo-3-7-3,10-dyhdroxy-9-

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

1. Nguyễn Tiến Bân (Chủ biên) và nnk (2003), Danh lục các loài thực vật ở Việt Nam. Tập 2. Nxb Nông nghiệp. Tr 779-786.

2. Bộ khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam (2007), Danh lục Đỏ Việt Nam, Nxb KHTN và CN. Tr 275.

3. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học. Tr 1252 4. Võ Văn Chi (2007), Từ điển thực vật học thông dụng, Tập 1, Nxb KHKT.

Tr 878-888..

5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, Nxb Trẻ, Tr 878 – 889.

6. Quỹ Quốc tế về bảo vệ thiên nhiên WWF (2003), Sổ tay điều tra và giám sát đa dạng sinh học, Nxb Giao thông vận tải.

Tài liệu Tiếng Anh

7. Chan S. C., Chang Y. S., Wang J. P., Chen S. C., Kuo S. C. (1998). Three new flavonoits and antiallergic, anti-inflammatory constituents from the heartwood of Dalbergia odorifera. Planta Medica, 64: 153-158.

8. Ito C., Itoigawa M., Kanematsu T., Ruangrungsi N., Mukainaka T., Tokuda H., Nishino H., Furukawa H.(2003). Isoflavonoids from Dalbergia oliveri. Phytochemistry, 64: 1265-1268.

9. Pathak V., Shirota O., Sekita S., Hirayama Y., Hakamata Y., Hayashi T., Yanagawa T., Satake M.(1997). Antiandrogenic phenolic constituents from Dalbergia cochinchiensis. Phytochemistry, 46: 1219-1223.

10.Shirota O., Pathak V., Sekita S., Satake M., Nagashima Y., Hirayama Y., Hakamata Y., Hayashi T.(2003). Phenolic constituents from Dalbergia cochinchinensis. Journal of Natural Products, 66: 1128-1131.

Yu X., Wang W., Yang M.(2007). Antioxidant activities of compounds isolated from Dalbergia odorifera T. Chen and their inhibition effects on the decrease of glutathione level of rat lens induced by UV irradiation. Food Chemistry, 104: 715-720.