Tại phòng sinh học thực nghiệm - Viện hoá học các hợp chất tự nhiên - Viện KH & CN Việt Nam, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng nấm của các chất tổng hợp được trên phiến vi lượng 96 giếng của các mẫu chất theo phưcíng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994).
2.4.2.1. Nguyên tắc của phép thử như sau
Bước 1 : Sàng lọc sơ bộ tìm chất tổng hợp có hoạt tính.
Bước 2 ; Tim nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính. Kháng sinh kiểm định là: Nystatin.
Chủng nấm đem kiểm định là: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.
2.4.2.2. Các bước tiến hành
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính
* Chuẩn bị vi sinh vật
“ Vi nấm được giữ giống trong môi trường: Saboraud dextrose broth. - Các chủng vi nấm được hoạt hoá trước khi tiến hành thử nghiêm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể 48 giờ.
* Chuẩn bị mẫu thử
- Hoà tan các chất trong dung dịch DMSO 100% bằng máy vortex với nồng độ 4 mg/ml.
- Từ dung địch gốc nhỏ sang phiôn vi lượng 96 giông.
- Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẩn dung dịch vi sinh vật đã hoạt hoá.
* Chuẩn bị đối chứng dươìig
- Dãy 1 : Môi trường.
- Dãy 2 : Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định.( Nỵstiatin được pha trong DMSO 100% ờ nồng độ 0,4 mM).
* Chuẩn bị đối chứng âm
* Đọc kết quả
- Mẫu dưcỉng tính khi nhìn bằng mắt thưồng thấy trong suốt không có vi
sinh vật phát triển giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2: Tìm nồng độ ức c h ế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính
* Các bước tiến hành
- Các bước tiến hành như ở bước 1; riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng
lọc ở bước 1 được pha loãng theo các nồng độ thấp dần, từ 5 - 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
* Đọc kết quả
- Nồng độ dưcỉng tính là nồng độ ở đó không có vi sinh vật phát triển, khi
nuôi cấy lại nồng độ này trên thạch đĩa để kiểm tra có giá trị CPU < 5. - Mẫu thô có MIC < 200 M-g/ml; mẫu tinh khiết có MIC < 50 |ug/ml là cớ
hoạt tính.
2.4.23. Kết quả vổ nhận xét
Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của các chất tổng hợp được ghi
ồ bảng 7 :
Bảng 7 : T h ử hoạt tính k h á n g nấm của các chất tổng hợp được
' fiíỉỉ'^M.4
íÌGhủngliam 3 ức-iặế tỐ itÌụ^ị(ặỊIC
M Ẹ M .V - >rW-- v m
Asp. niger 50 50 (-) (-) (-) 50
F. oxysporum 12,5 50 C-) (-) 25 25
Qua bảng trên ta thấy 3 chất (II, III, IX) có hoạt tính trên cả 2 chủng vi nấm thử nghiệm, hai chất (VI, VII) đều không có tác dụng, chất VIII chỉ có hoạt tính trên chủng p.oxysporum.
2.43. Thử tác dụng kháng tế bào ung thư [5];[8];[14J;[21].
Theo các tài liệu tham khảo được cho thấy một số dẫn chất của thiazolidin-2,4-dion có tác dụng chống phân bào mạnh trên mô phân sinh thực vật, có hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thử tác dụng kháng tế bào ung thư của các chất tổng hợp được.
2.4.2.1. Nguyên tắc
Phưctig pháp thử ngiệm hoạt tính kháng các dồng tế bào ung thư được tiến hành theo mô hình thử nghiệm đang được lưu hành và áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI).
Tế bào thử nghiệm có nguồn gốc tại các dòng tế bào ung thư người: - Hep - 2 : Tế bào ung thư gan người.
2.4.2.2. Tiến hành
* Tế bào ung thư gan người được duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn và được thử test với các chất thử đã được chuẩn bị sẩn ở các nồng độ khác nhau trên phiến vi lượng 96 giếng trong dung mồi DMSO 10%.
* Mẫu thử ngiệm (bao gồm tế bào + môi trường nuôi cấy + chất thử) được ủ ở 37°c để tế bào phát triển.
* Sau 72 giờ lấy tế bào ra, cố định, rửa nhuộm và hoà lại bằng dung dịch chuẩn. Đọc kết quả trên máy đo Elisa ở bước sóng 495- 515 nm. Nồng độ ức
chế tế bào ung thư của chất thử được tính bằng đại lượng IC5Q.
* Đọc kết quả và biện luân:
- Giá trị ICgo được tính trên chương trình Table curvet với giá trị logarit dựa trên giá trị thang nồng độ khác nhau cùa các chất thử và giá trị ED (liểu lượng tác dụng) đo được, các mẫu có giá trị IC50 khác nhau.
- Các mẫu chất tinh khiết có giá trị IC5Q < 5 Ịig/ml được coi là có hoạt tính.
* Lưu ý:
Song song làm phiến đối chứng OD (ngày 0) để đối chứng cho lượng tế bào ở thctì điểm bắt đầu thí nghiệm.
v ề đối chứng âm: Giá trị OD của DMSO 10% để làm đối chứng cho giá trị của lượng tế bào khi kết thúc thí nghiêm. Cách cố định và rửa làm như với các mẫu thử.
* Dựa vào kết quả đo được của chứng OD (ngày 0) và OD của DMSO 10% so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu chất thử để tìm giá trị ED^O theo công thức:
OD (mẫu) - OD (ngày 0) ED =
OD (DMSO 10%) - o D (ngày 0)
X 100%
Mẫu có giá trị ED < 50% là mẫu có hoạt tính, dùng giá trị ED50 của 10 thang nồng độ dựa vào chương trình Table curvet theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC^Q.
ln Y = a + bX Y : nồng độ chất thử.
X ; giá trị ED.
Do điều kiện kinh phí, chúng tôi chỉ chọn ra hai chất mới III và VII được dự đoán có hoạt tính đem thử tác dụng kháng hai dòng tế bào ung thư nói trên.
2.4.23. Kết quả
Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư cho thấy cả hai chất (III, VII) đem thử đều âm tính. Kết quả cụ thể được trình bày à bảng 8.
Bâng 8 : T h ử hoạt tính kh á n g u n g th ư của ha i chất I I I và V II
hieu mấủc -'ũ-ụ íỉtíD òngtếbàoj GeUấurvival (%) : K ế t l u ậ n ^ 1 DMSO 1 0 0 , 0 ± 0 , 0 2 Chứng (+) 2,05 ± 0,02 3 n i n 76,6 ± 0,07 Am lính 4 VII 100,4 ± 1,4 Am lính
2.5, BÀN LUẬN
2,5.1. v ể tổng hợp hóa học và phán tích cấu trúc
Qua tổng hợp thiazolidin-2,4-dion và 8 dẫn chất 5- aryliden- thiazolidin- 2,4-dion cho phép chúng tôi rút ra một số kết luận sơ bộ về mối liên quan giữa
‘'cấu trúc hoá học và khả nâng phản ứng
- Phản ứng tổng hợp thia2ôlidin-2,4-dion (I) thực hiện dễ dàng và đạt hiệu suất cao như các tài liệu đã công bố.
- Phản ứng ngưng tụ thiazolidÌn-2,4-đÌon với các aldehyd thơm được thực hiện trong môi trường AcOH băng với xúc tác là AcONa khan. Kết quả thu được tương tự như nhiều công trình khác đã công bố.
- Thcd gian phản ứng tổng hợp chất III, IV, IX ngắn do trong cấu trúc phân tử của hợp phần alđehyd có nhóm -N O2, nhóm này gây ra hiệu ứng cảm ứng hút điện tử ( -1) cùng chiều với hiệu ứng liên hợp trên nhân thơm làm tăng
khả năng hoạt động của nhóm - CHO. Trong đó chất IV có thời gian phản ứng
dài hcfn hai chất III và IX do nhóm -N O2, nằm ở vị trí oitho làm xuất hiện thêm hiệu ứng cản không gian,
- Aldehyd tham gia tổng hợp chất V, VI, VII mặc dù chứa các nhóm thế
có hiệu ứng cảm ứng hút điện tử như (- Cl; - OH; - 0CH3) nhưng do C1 và o
còn cặp điện tử không phân chia nên đồng thời chúng lại có hiệu ứng liên hợp đẩy điện tủ (+ M) ngược chiều với hiệu ứng cảm ứng hút điện tử. Kết quả là khả năng hoạt động của nhóm - CHO không được tăng lên và thời gian phản ứng kéo dài.
- Trong tổng hợp chất IX chúng tôi nhân thấy yếu tố nhiệt độ đóng vai trò rất quan trọng. Nhiệt độ thích hợp duy trì phản ứng là 110 - 115“c, nếu ta tăng nhiệt độ phản ứng lên sẽ xảy ra hiện tượng hoá nhựa sản phẩm. Lí do: Có thể khi ở nhiệt độ cao cùng với sự có mặt của acid thì 5-nitrofurfural không bền dễ bị oxy hoá, tạo sản phẩm phụ trung gian tiếp theo đó là quá trình polyme hoá sản phẩm.
- Để xác định độ tinh khiết và cấu trúc các chất tổng hợp được chúng tôi đã tiến hành đo phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, phổ khối lượng và phân tích các phổ đồ ở mục 2.3. Các kết qủa thu được cho thấy các chất tổng hợp được có cấu trúc đúng như dự kiến. Tuy nhiên chúng tôi hiểu rằng để khẳng định chắc chắn hơn thì phải tiến hành đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR, phổ cộng hưởng từ proton ‘H- NMR trong cấu trúc,
2.5.3. Về tác dụng sinh học
2.5.3.1, V ề hoạt tính kháng khuẩn
Từ kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trình bày ở mục 2.4.1 và bảng 6 cho phép chúng tôi rút ra một số nhận xét sơ bộ về môĩ ỉiên quan cấu trúc - tác dụng sinh học sau đây:
- Cấu tạo của các hợp phần aldehyd trong các dẫn chất 5-aryliđen- thiazolidin-2,4-dion có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng khuẩn. Hai chất (II, VIII) có hợp phần aldehyd là benzaldehyd và furfural thì không có tác dụng trên tất cả các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Trong khi đó các chất có hợp phần là benzaldehyd thế n h ư : m-nitro benzaldehyd (III); vanilin (VI); aldehyđ salicylic (VII) và 5-nitrofurfural (IX) đã thể hiện tác dụng khá rõ rệt. Đặc biệt là chất IX (chứa gốc 5- nỉtro -2- furfuryliden) có tác dụng rất mạnh trên hầu hết các chủng vi khuẩn. Qiứng tỏ các nhóm thế có ảnh hưởag lớn đến cấu trúc phân tử và hoạt tính kháng khuẩn của chúng.
- Có thể nhân thấy các nhóm thế - NO2; - OH; - 0CH3 đã góp phần mang lại hoạt tính kháng khuẩn cho các chất tổng hợp, điều này cũng tương tự như đã thấy ở nhiều dãy chất khác, ở chất IX có lẽ yếu tố cấu trúc 5-nitro furfuryliden đã góp phần mang lại hoạt tính kháng khuẩn cao tương tự như các thuốc kháng khuẩn họ nitrofuran.
2.5 J .2 , V ề hoạt tính kháng nấm
Kết quả thử tác dụng kháng nấm trên hai chủng Aspergillus niger, Fusarium oxỵsporum được ghi ở bảng 7 cho thấy:
- Các nhóm thế của hợp phần aldehyđ thcfm trong cấu trúc không có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng nấm. Rất đáng chú ý là chất II có gốc benzaldehyd lại có hoạt tính mạnh nhất trong các chất thử nghiệm, còn dẫn chất chứa nhóm m-nitro benzaldehyd (III) lại có tác dụng kém hcfn. Trong khi đó phân tử hai chất có hợp phẩn là các benzaldehyd thế như vanilin (VI) và chất aldhehyd salicylic (VII) lại cho kết quả âm tính. Hai chất VIII (gốc furfuryliden) và chất IX (gốc 5-nitro- 2-furfurylidcn) đều có tác dụng.
- Hiện tượng này có thể được lý giải là: Do cấu trúc của toàn phân tử và các tính chất lỷ hoá như độ tan, hệ số phân bố dầu nước...v.v. của các chất tổng hợp được là khác nhau dẫn đến khả năng thấm cũng như tiếp nhận các receptor trên tế bào nấm là khác nhau. Vì vậy iàm ảnh hưởng tới hoạt tính kháng nấm. Từ các kết quả trên ta nhận thấy mối liên quan cấu trúc - tác dụng sình học là rất phức tạp.
2.5.J.3. v ể hoạt tính kháng tế bào ung thư
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư cho thấy chất III có hoạt tính yếu, mức sống sót đối với dòng Hep - 2 là 74,6%. Tuy vậy cả hai chất (III, VII) đem thử đều cho kết quả âm tính. Mặc đầu vậy chúng ta vẫn có thể hy vọng một kết quả khả quan hcfn khi tiếp tục thử tác dụng các chất tổng hợp khác ưên dòng Hep - 2 và một số dòng tế bào ung thư khác như : FL “ Tế bào ung thư màng tử cung người, KB “ Tế bào ung thư biểu mô người. Từ đó sàng lọc những chất có tác dụng mạnh và tiếp tục các thử nghiêm sâu hơn.
* K ết l u ậ n :
Các dãn chất của ngưng tụ của thiazolidin - 2,4 - dion với các aldehyd thcfm đã mang lại những hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm nhất định nhưng không mang lại hoạt tính kháng tế bào ung thư đối với 2 chất được thử. Tuy nhiên nếu có điều kiện tiếp tục chúng tôi sẽ tiến hành thử tác dụng này đối với các chất còn lại để có được những nhận xét toàn diện hơn về tác dụng sinh
PHẦN 3
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
Từ những kết quả nghiên cứu trình bày trên đây chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1 - Chúng tôi đã tổng hợp được thiazolidin-2,4-dion (I) và 8 dẫn chất 5- aryliden- thiazolidÌn-2,4-dion (II - IX), trong đó có 3 chất (III, IV, VII) chưa thấy công bố trong các tài liệu tham khảo được.
2 - Đã kiểm tra độ tinh khiết của tất cả các chất tổng hợp được bằng SKLM và đo nhiệt độ nóng chảy. Xác định cấu trúc bằng phân tích quang phổ tử ngoại, quang phổ hồng ngoại và phổ khối lượng (đối với hai chất III, VII). Kết quả cho phép chúng tôi kết luận sơ bộ là tất cả các chất tổng hợp được đều có cấu trúc đúng như dự kiến.
3 - Đã thử tác đụng kháng khuẩn của 6 chất (II. III, VI, VII, VIII, IX) tổng hợp được với 10 chủng vi khuẩn, gồm 5 chủng Gram dương là: Bacillus
cereus, Bacillus pumiỉus, Bacillus subtilis, Staphyỉococciis aureus, Sarcina
ỉutea và 5 chủng Gram âm là: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Proteus mirabỉỉis, Shigella flexneri, Salmonella typhi. Kết quả cho thấy ở
nồng độ 2mg/ml hai chất (III, VII) có tác dụng ưên 7 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Đặc biệt chất IX có tác dụng rất mạnh trên 9 chủng vi khuẩn (trừ
Pseuảomonas aeruginosa). Chất VI chỉ tác dụng trung bình trên 3 chủng, hai
chất (lĩ, VIII) âm tính trên tất cả các chủng vi khuẩn thử nghệm.
4 - Đã thử tác đụng kháng nấm của 6 chất (II, III, VI, VII, VIII, IX) trên 2 chủng vi nấm là: Aspergiluts nigier, Fusarium oxysporum, Kết quả cho thấy
(VI, VII) đều không có tác dụng, chất VIII chỉ có tác dụng trên chủng
Fusarium oxysporum.
5 • Đã thử tác dụng kháng ung thư của hai chất (III, VII) trên dòng tế bào ung thư gan người (Hep - 2). Kết quả cho thấy chất VII không có tác dụng còn chất III chỉ có tác dụng yếu trên dòng ung thư này.
* Đề xuất
Với các kết quả đã đạt được trong quá trình thực nghiệm chúng tôi hy vọng góp một phần nhỏ làm phong phú thêm các nghiên cứu về dãy dẫn chất thiazolidin-2,4“dion. Để tiếp tục và phát triển các kết quả đã đạt được chúng tôi có một số đề xuất sau đây:
- Cẩn tiếp tục thử nghiệm sâu hcfn và rộng hcfn về hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tế bào ung thư của tất cả các chất các chất tổng hợp được.
- Tiến hành tổng hợp các dẫn chất mới của thiazoliđin-2,4-dion và thử sàng lọc tác dụng sinh học của các chất của các chất tổng hợp được, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học cao để hưóíng tới ứng dụng vào thực tế lâm sàng.
TÀI LIỆU TH A M KHẢO
TIẾNG VIÊT
1. Bộ môn hoá hữu cơ (1999), Hoá hữu cơ, Đại học Dược Hà Nội, tập I, II. 2. Bộ môn hoá hữu cơ (2004), Hoà hữu cơy Đại học Dược Hà Nội, tập I. 3. Bộ y tế (2002), Dược điển Việt Nam ỈU, Nhà xuất bản y học, PL 10.
4. Phan Đình Châu (2003), Các quá trình cơ bản tổng hợp hoá dược hữu cơ,
Nhà xuất bản ĐHQG thành phố Hồ Chí Minh, tr. 39- 52 ; tn 72-86.
5. Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải, Ngô Mai Anh, Nguyễn Thị Thủy (2000), Tổng hợp và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5- (5’- nitro- 2 ’- furfuryiiden) - thiazolidin-2,4-dion và dẫn chất, Tạp chí dược học, (10),
tr.l2- 14.
6. Nguyễn Quang Đạt, Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự (2001), Tổng hợp và tác đụng kháng khuẩn, kháng nấm của 5“ nitrofurfural, Tuyển tập các công trình hội nghị khoa học và cồng nghệ Hoá hữu cơ toàn quốc lần thứ hai
(12/2001).