1. 2 Các thuốc chống viêm
4.1. Dịch chiết Saponin Kim ngân cuộng toàn phần
Để có dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp kinh điển đã được ghi trong nhiều tài liệu chính quy. Trước tiên dùng ethanol 80° để chiết các hoạt chất trong kim ngân cuộng ( trong đó có saponin ). Loại tạp là các chất béo, các chất diệp lục có trong dịch chiết bằng cloroíorm, sau đó tách lấy saponin bằng n-butanol. Các phản ứng định tính được tiến hành nhằm khẳng định trong dịch chiết n-butanol có hoạt chất saponin. Tuy nhiên với các phản ứng định tính như phản ứng tạo bọt, phản ứng phá huyết chúng tôi mới chỉ sơ bộ kết luận trong thành phần của dịch chiết có hoạt chất thuộc nhóm phân loại hoá học saponin. Hiện nay, phương pháp sắc kí lớp mỏng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu xác định thành phần hoá học của dịch chiết dược liệu. Chúng tôi tiến hành sắc kí lớp mỏng dịch chiết saponin kim ngân cuộng với hệ dung môi ethylacetat : methanol : nước ( 100: 23 :7). Bản sắc kí đem soi dưới ánh đèn tử ngoại cho các vết khá rõ. Tuy nhiên trong khuôn khổ đề tài, trong điều kiện không có chất chuẩn để xác định hoạt chất cụ thể nhưng bước đầu tìm được hệ dung môi thích hợp có khả năng tách các hoạt chất trong phương pháp sắc kí tạo thuận lợi cho các nghiên cứu về sau.
4.2. TÁC DỤNG CỦA SAPONIN KIM NGÂN CUỘNG Đ ốl VỚI HOẠT TÍNH CỦA a-CHYMOTRYPSIN TRÊN IN VITRO.
Kết quả thực nghiệm cho thấy dịch chiết saponin kim ngân cuộng có khả năng kích thích hoạt tính của a-chymotrypsin trên cơ chất casein. Với hàm lượng 0,005 mg saponin kim ngân cuộng có khả năng kích thích a-
chymotrypsin mạnh nhất. Có thể là vị thuốc này ở nồng độ nhỏ kích thích vào
trung tâm hoạt động của a-chymotrypsin. Khi nồng độ tăng lên, sự kích thích được tăng cưoiig do đó khả năng kích thích hoạt tính a-chymotrypsin tăng lên nhưng đến một mức độ nào đó sẽ không tăng nữa.
Thời gian và nhiệt độ ảnh hưởng nhiều đến khả năng thuỷ phân của a-
c h y m o t r y p s i n . Khi thời gian, nhiệt đ ộ càng lớ n thì khả năng thuỷ phân c ủ a a -
chymotrypsin càng tăng nhưng đến một mức độ nào đó khả năng thuỷ phân của a-chymotrypsin sẽ tăng chậm. Sự kết hợp của saponin kim ngân toàn phần với a-chymotrypsin không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của tác nhân thời g ia n v à n h iệ t đ ộ đ ế n h o ạ t tín h c ủ a a - c h y m o tr y p s in , c h ứ n g tỏ s a p o n in k im ngân toàn phần không làm thay đổi bản chất của a-chymotrypsin mà chỉ có t á c dụng k í c h t h í c h .
4.3. TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA DỊCH CHIẾT SAPONIN KIM NGÂN CUÔNG TOÀN PHẦN VÀ a-CHYMOTRYPSIN TRÊN MÔ HÌNH NGÂN CUÔNG TOÀN PHẦN VÀ a-CHYMOTRYPSIN TRÊN MÔ HÌNH GÂY VIÊM CẤP.
Trong khuôn khổ đề tài, để đánh giá tác dụng chống viêm của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần và a-chymotrypsin chúng tôi sử dụng mô hình gây phù chân chuột bằng carragenin 1%. Mô hình gây viêm cấp bằng carragenin được Winter và cộng sự mô tả, áp dụng năm 1962. Cho đến nay mô hình này vẫn là mô hình kinh điển thử tác dụng chống viêm cấp. Carragenin là polysaccharid, dễ tan trong nước, khi pha thành dung dịch 1% tạo dung dịch đồng nhất thuận lợi cho việc phân liều. Độ phù chân chuột đạt giá trị lớn nhất vào thời điểm 3 giờ sau khi tiêm. Kết quả trên thực nghiệm cũng phù hợp với nghiên cứu đó.
a- Chymotrypsin dạng ống tiêm 5mg/rnl là chế phẩm được lưu hành rộng rãi trên thị trường, dùng trong các trường hợp phù nề do chấn thương hay sau
phẫu thuật. Với dạng ống tiêm, a-chymotrypsin dễ sử dụng trong thực nghiệm, đạt được hiệu quả tối đa.
Trong mô hình gây viêm, tác dụng chống viêm của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần được nghiên cứu ở các thời điểm khác nhau so với thời điểm tiêm carragenin. Từ đó tìm ra thời gian tác dụng chống viêm tốt nhất của dịch chiết saponin kim ngân góp phần nghiên cứu dược động học của saponin trên thực nghiệm.
Kết quả thực nghiệm cho thấy saponin kim ngân cuộng toàn phần có tác dụng ức chế phù với liều lượng l,5g kim ngân cuộng/kg. Nhưng tỷ lệ ức chế phù của kim ngân cuộng dùng đơn độc thấp hơn indomethacin. Việc thử tác dụng ức chế phù của a-chymotrypsin một lần nữa khẳng định tác dụng chống viêm cấp của a-chymotrypsin . Tỷ lệ ức chế phù tăng cao rõ rệt ở lô chuột dùng kết hợp dịch chiết saponin kim ngân và a-chymotrypsin , xấp xỉ tác dụng ức chế phù của indomethacin 5mg/kg. Từ đó cho thấy có sự hiệp đồng tác dụng ức chế phù của dịch chiết saponin kim ngân toàn phần và a-chymotrypsin trên in vitro.
Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng chống viêm của saponin nói chung và đã đưa ra một số giả thuyết về cơ chế chống viêm của saponin. Saponin ức chế yếu tố chuyển dạng NFkB- là tác nhân kích thích enzym iNOS ( enzym tổng hợp yếu tố gây viêm NO ); triệt tiêu các gốc tự do kích thích phản ứng viêm; ức chế sự tổng hợp yếu tố hoại tử khối u TNF-a; giảm sự giải phóng cytokin từ các tế bào viêm. Trong khi đó, a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein . Vai trò của a-chymotrypsin là thuỷ phân các protein đã bị biến tính, sợi tơ huyết, mảnh vụn tế bào sinh ra trong quá trình viêm. Ngoài tác dụng thuỷ phân đơn thuần a-chymotrypsin tham gia vào đáp ứng miễn dịch thể dịch và tế bào trong quá trình viêm. Các nghiên cứu cho thấy a-chymotrypsin ức chế giải phóng serotonin, thuỷ phân các receptor trên màng tiểu cầu, tham gia
hoạt hoá tế bào lympho T, ức chế giải phóng leukotrien từ bạch cầu đơn nhân tiuiig tính. Cơ chế tác động của saponin trong các giai đoạn khác nhau của quá trình viêm có thể là giả thiết cho tác dụng hiệp đồng của các chất này. Kết quả thực nghiệm phần nào phù hợp với giả thiết trên.
Tuy nhiên chúng tôi mới chỉ nghiên cứu sơ bộ hoạt tính chống viêm của saponin kim ngân kết hợp với a-chymotrypsin . Vẫn còn nhiều điểm cần tiếp tục nghiên cứu và bổ sung như tìm liều tác dụng tối ưu của saponin kim ngân, cơ chế hiệp đồng tác dụng của saponin kim ngân và a-chymotrypsin ,sự biến đổi các chỉ số hoá sinh và các chỉ tiêu miễn dịch viêm, nghiên cứu tác dụng của saponin kim ngân cuộng kết hợp với a- Chymotrypsin trên mô hình gây viêm mạn tính.
Trong khuôn khổ đề tài, saponin kim ngân cuộng được chứng minh là có tác dụng chống viêm trên in vivo. Mặt khác, khi phối hợp saponin kim ngân cuộng và a-chymotrypsin tác dụng chống viêm được tăng cường. Trên in vitro, saponin kim ngân cuộng có tác dụng kích thích hoạt tính của a- Chymotrypsin. Kết hợp thành công dịch chiết saponin kim ngân và a-chymotrypsin trên mô hình gây viêm cấp đạt được hiệu quả chống viêm tương đương với thuốc chống viêm hoá dược. Từ đây, mở ra một hướng nghiên cứu tiếp theo về khả năng kết hợp a-chymotrypsin với các dược liệu chống viêm khác nhằm thu được hiệu quả chống viêm tốt hơn và góp phần phát huy tác dụng của nguồn dược liệu sẵn có trong nước. Xa hơn nữa, việc nghiên cứu thuốc chống viêm đông tây y kết hợp là một hướng đi rộng mở và khả quan.
KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT
Qua các kết quả nghiên cứu chúng tôi rút ra một số kêt luận sau:
1. Dịch chiết saponin kim ngân cuộng với hàm lượng 0,005 mg có khả năng kích thích hoạt tính của a- chymotrypsin trên cơ chất casein, với hàm lượng lớn hơn hay nhỏ hơn khả năng này giảm đi.
2. Sự kết hợp dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần không làm thay đổi quy luật ảnh hưởng của tác nhân thời gian và nhiệt độ đến hoạt tính của a-chymotrypsin .
3. Dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần với liều tương ứng l,5g kim ngân cuộng/kg có tác dụng chống viêm tốt trên mô hình gâv viêm cấp.
4. Dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần cho tác dụng chống viêm tốt nhất vào thời điểm 3 giờ sau khi chuột uống.
5. Khi kết họp dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần và a-
chymotrypsin với liều tương ứng l,5g kim ngân cuộng/kg + l,5mg a-
chymotrypsin /kg, tác dụng chống viêm tăng cao thể hiện tác dụng hiệp đồng của hai hoạt chất trên mô hình gây viêm cấp. Tác dụng hiệp đồng ở liều đã thử ỉà tương đương với indomethacin liều uống 5mg/kg.
Từ những kết quả trên thu được trong quá trình làm thí nghiệm, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau:
1. Thử tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm mạn của saponin kim ngân cuộng khi dùng đơn độc và khi kết hợp với a-chymotrypsin .
2. Theo dõi nhiều thêm về sự biến đổi chỉ số sinh học và hoá sinh để có cơ sở đầy đủ hơn trong việc đánh giá hiệu quả của các thuốc chống viêm chống viêm.
3. Tim hiểu phương pháp chiết tách, phân lập các thành phần lonicerosid A, B,
c trong saponin kim ngân cuộng và nghiên cứu cụ thể tác dụng chống viêm
của từng chất.
4. Tim hiểu cơ chế hiệp đồng tác dụng ở mức độ phân tử giữa saponin kim ngân cuộng và a-chymotrypsin .
5. Nghiên cứu phương pháp bào chế thích hợp loại thuốc chống viêm có sự kết hợp giữa a-chymotrypsin với saponin cây kim ngân và hướng dẫn sử dụng hợp lý, an toàn, hiệu quả.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vũ Triệu An ( 2001), Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội, tr. 250- 252. 2. Bộ môn dược lâm sàng Đại học Dược Hà Nội(2003), Dược lâm sàng, tr 3. Bộ môn hóa sinh Đại học Dược Hà Nội (2001), Hoá sinh, tập l,tr 112-162. 4. Bộ môn miễn dịch và sinh lý bệnh Đại học Y Hà Nội (1991), Sinh lý bệnh,
NXBYhọc, tr. 202-218
5. Võ Văn Chi (1997), Từ điển câ\' thuốc Việt Nam, NXB Yhọc, tr 633-634. 6. Nguyễn Hoàng Hải (2001), Nghiên cứu tác dụng chống viêm của núc nác
kết hợp với a- Chymotrypsin, Luận văn thạc sĩ dược học, tr.9-11.
7. Lê Thị Diễm Hồng (2002), Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm của hoa cây kim ngân ( lonicera japónica thiinb. Caprifoliaceae) kết hợp với
a-chymotrypsin, Luận văn thạc sĩ dược học. 18-20.
8. Đỗ Tất Lợi( 2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 75-77.
9. Nguyễn Đức Lượng và cộng sự (2004), Công nghệ enzym, NXB Đại học quốc gia Hổ Chí Minh, tr 282- 286
10.Lê Đình Roanh, Nguyễn Đình Mão (1997), Bệnh học viêm và nhiễm
khuẩn, NXB Y học, tr. 1-132.
11. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thuý(2001), Thuốc biệt dược và cách sử dụng,
NXB Y học, tr. 205-206.
12.Ngô Văn Thu ( 1990), Hoá học saponin, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, 109, 170- 183.
\2>.Từđiển bách khoa dược học{ 1999), NXB Từ điển bách khoa, Hà Nội, tr. 138,630-632.
14. Viện dược liệu (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa bọc kỹ thuật, tr 609-617.
15.Goodman and Gilman (1996), The pharmacological basis o f therapeutic
9^^ edition, pp. 617- 655.
lổ.Martindal (1996), the extra pharmacopoeia- 31"‘ edition, The royal Pharmaceutical Society, pp. 1689- 1690.
17.Wie Jong Kwak, Chang Kyun Han, Hyeun Wook Chang, Hyun Pyo Kim, Sam Sik Kang, and Hun Ho Son (2003), Chem. Pharm. Bull. Vol 51. No 3. pp 333-335.
IS.Oshima G (1988), " Enhance proteolysis of bovine fibrinogen in the presence of poly sulfates", Throm. Res, Jan. 15, pp 181- 191.
19.J. Tae et al (2003), Clinica Chimica Acta 330, pp 165-171.
20.C.A. Winter et al( 1962), Carragenin-induced oedema in hind paw o f the rat as assay for anti-inflammatory drugs, Proc. Soc. exp. Biol. Med, No
