1. Thu nhận mẫu:
Trước khi lấy mẫu, dụng cụ cần được thanh trùng bằng cồn. Túi đựng mẫu đã được thanh trùng ướt. Các mẫu cỏ khô và rơm khô được lấy ở khu vực quận Hoàng Mai và ngoại thành Hà Nội.
2.Phương pháp phân lập vi sinh vật:
Chuẩn bị môi trường phân lập, đem khử trùng ướt ở 1atm/30 phút. Đổ môi trường đã khử trùng vào các đĩa petri sạch đã được khử trùng. Cân, cắt nhỏ 1g mẫu thu được, cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng, lắc đều.
Chuẩn bị các ống nghiệm có 9ml nước vô trùng dùng để pha loãng mẫu. Dùng pipetman hút 1ml mẫu ở ống nghiệm mẫu (nồng độ 10-1) nhỏ vào ống nghiệm chứa 9ml nước vô trùng ở trên, lắc đều. Ta thu được dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy ta sẽ thu được dịch pha loãng ở các nồng độ 10-3, 10-4, 10- 5,10-6 …
Cấy từ các nồng độ pha loãng 10-4, 10-5,10-6.
Thể tích vật liêu cấy cho mỗi đĩa môi trường là 0.1ml dịch huyền phù. Mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần.
Sử dụng que chang thủy tinh để dàn đều các tế bào lên bề mặt thạch. Que chang được vô trùng bằng cồn và ngọn lửa đèn cồn rồi để nguội trong điều kiện vô trùng trước khi cấy.
Nuôi cấy trong tủ ấm 40oC trong vòng 48h đem nhỏ thuốc thử lugol. Tiếp tục cấy chuyển các khuẩn lạc có vòng phân giải cho đến khi thuần giống.
3. Phương pháp giữ giống:
Sử dụng môi trường giữ giống ở trên.
Cấy chuyển khuẩn lạc cần giữ giống vào môi trường giữ giống rồi đem ủ ở 400C trong 24h trước khi đem bảo quản trong tủ lạnh.
4. Phương pháp xác định hoạt lực enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch:
Sử dụng môi trường thử hoạt tính ở trên.
Sau khi thanh trùng, đổ môi trường vào các đĩa petri. Đục lỗ thạch với đường kính 5mm.
Nhỏ 50µl dịch li tâm vi sinh vật vào lỗ thạch.
Cho vào trong tủ lạnh trong 4h cho dịch khuếch tán đều vào môi trường. Sau đó đặt vào tủ ấm để enzym hoạt động.
Sau 48h tiến hành nhỏ lugol kiểm tra hoạt tính. Vùng CMC bị phân giải là vùng không màu xung quanh lỗ đục. Hoạt lực của enzym biểu thị bằng giá trị D- d (mm) với D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ thạch.
5. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật:
1. Nhiệt độ:
Hoạt hóa và nuôi cấy dịch thể các chủng vi sinh vật ở các nhiệt độ 25, 35, 45, 55oC
Hoạt hóa và nuôi cấy dịch thể các chủng vi sinh vật ở dải pH 3, 4, 5, 6, 7 Tiến hành kiểm tra hoạt độ bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 3. Thời gian:
Khảo sát thời gian nuôi cấy, chúng tôi tiến hành xác định mật độ tế bào ở các thời điểm khác nhau bằng cách đo độ đục dịch nuôi cấy trên máy đo quang.
6. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym thô thu được từ các chủng đã phân lập:
1. pH:
Dựa vào sự thủy phân cơ chất CMC bởi enzym CMCaza ở các pH 3, 4, 5, 6, 7 trong khi giữ nguyên nhiệt độ 35oC
Lượng đường khử sinh ra được cho phản ứng với DNS
Màu sinh ra sau phản ứng được xác định bằng phương pháp so màu trên quang phổ kế ở bước sóng 540nm.
2. Nhiệt độ:
Sau khi đã khảo sát ảnh hưởng của pH, chọn pH thích hợp cho từng chủng vi khuẩn, thay đổi nhiệt độ từ 25, 35, 45, 55oC.
Cách tiến hành cũng tương tự như trên.
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật ưa nhiệt có khả năng sinh tổng hợp xenlulaza:
Từ các mẫu cỏ khô và rơm rạ mục, chúng tôi đã tiến hành phân lập và thu được trên 30 chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy xenluloza. Với mục đích tuyển chọn những vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza cao, chúng tôi đánh giá và phân lập các chủng vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán enzyme trong thạch CMC (hình 1). Kết quả chúng tôi đã thu được có 6 chủng vi khuẩn có vòng phân giải xenluloza cao nhất như trong bảng 1.
Bảng 1. Các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân xenluloza
Stt Tên chủng Loại mẫu Hoạt tính xenluloza (D-d mm) 1 312 Rơm khô 32 2 342 Rơm khô 32 3 242 Cỏ khô 25 4 M221 Cỏ khô 26 5 B3 Chất chứa dạ cỏ 28 6 B6 Rơm mục 28
Mục đích mà chúng tôi tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính xelluloza mạnh là để ứng dụng trong xử lý rơm rạ thành cơ chất hữu cơ, vì vậy, ngoài hoạt tính này, vi khuẩn còn phải có một số đặc tính sinh học khác như khả năng chịu nhiệt, chịu được pH thấp do trong quá trình ủ đống, nhiệt độ đống ủ tăng cao do hoạt động của các vi sinh vật trong đống ủ, pH cũng giảm dần do các vi khuẩn sinh axit có sẵn trong đống ủ sinh ra. Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy 6 chủng vi khuẩn trên ở các nhiệt độ khác nhau (25, 35, 45, 55oC) và các pH khác nhau (3, 4, 5, 6, 7). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 2 và 3.
Bảng 2a. Kết quả thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau
Tên chủng
Hoạt độ enzym ở dải pH từ 3-7 ở các mức nhiệt độ thường (D-d mm)
25oC 35oC 7 6 5 4 3 7 6 5 4 3 B3 20 19 14 5 0 22 22 20 6 4 312 16 14 0 0 0 20 19 0 0 0 M221 13 12 0 0 0 20 20 17 0 0 342 25 21 4 0 0 27 26 4 2 0 242 22 20 0 0 0 26 26 0 0 0 B6 18 11 0 0 0 21 20 0 0 0
Bảng 2b: Kết quả thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác nhau
Tên chủng
Hoạt độ enzym ở dải pH từ 3-7 ở các mức nhiệt độ cao (D-d mm)
45oC 55oC 7 6 5 4 3 7 6 5 4 3 B3 32 29 29 18 15 18 16 5 4 0 312 30 20 0 0 0 16 3 0 0 0 M221 27 28 18 0 0 13 10 0 0 0 342 30 27 27 16 0 19 15 5 6 0 242 24 21 0 0 0 15 12 0 0 0 B6 26 28 25 0 0 15 14 13 0 0