2.2.2.1. Định tính sơ bộ cắc nhóm chất trong dược liệu (thân) > Đinh tính Aỉcaỉoid
Lấy 5g bột dược liệu thô cho vào bình nón dung tích 200- 250ml, thấm ẩm được liệu bằng dung dịch NH4OH 6N, trộn thấm đểu, đậy kín, để yên 30 phút. Sau đó để khô tự nhiên. Thêm vào bình nón 50 ml Cloroform, lắc 5- 10 phút, để yên Ih. Gạn lọc qua giấy lọc không gấp nếp thu được dịch Qiloroform.
Lấy 30 ml dịch chiết Cloroform cho vào bình gạn, thêm dd H2SO4 10%
đến phản ứng acid, lắc 2- 3 phút, sau đó để yên cho đến khi 2 lớp trong suốt. Gạn phần acid để làm phản ứng.
Q io vào 4 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết. Thêm vào từng ống: Ống 1 : 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer
Ông 2 : 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff Ống 3 : 2 - 3 giọt thuốc thử Bouchardat Ống 4: 2- 3 giọt acid picric 1%
Kết quả:
Ống 1 : có tủa trắng (phản ứng dưcfng tính)
Ống 2: có tủa màu da cam (phản ứng dương tính)
ô n g 4: có tủa màu vàng (phản ứng dưcmg tính)
N hận x é t qua kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu có alcaloid.
^ Đinh tính sỉycosìd tim
Lấy lOg dược liệu khô đã tán nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, thêm lOOml nước cất, ngâm ở nhiệt độ phòng 24h. Gạn dịch vào cốc có mò, thêm vào dịch gạn 5 ml đung dịch chì acetat 30%, khuấy đều, để lắng, tiếp tục thêm dđ chì acetat đến khi không còn tủa nữa, để ỉắng, gạn, lọc lấy dịch trong. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn 125ml. ơ iiế t glycosyđ tim bằng 15 ml chloroform (chia làm 3 lần, mỗi lần 3 ml). Gạn lớp Qoroform vào cốc có mỏ khô, dịch gạn phải trong suốt, nếu còn lẫn nước phải lọc qua bông. Chia đều dịch vào bốn ống nghiệm nhỏ, bốc hod trên nồi cách thủy đến khô, cắn còn lại tiến hành phản ứng:
Phản ứng Liberman
Cho vào ống nghiệm chứa cắn trên Iml anhydrid acetic, lắc đều đến khi tan hết cán. Nghiêng thành ống nghiệm 45®, cho thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống nghiệm phân thành
2 lớp.
Kết quả: có xuất hiện vôngftim đỏ/giữa lớp phân cách. Lắc nhẹ ống nghiêm, lớp chất lỏng phía ưên có màu xanh lá cây (Phản ứng dưcỉng tính)
Phản ứng Baljet
Cho vào ống nghiêm có chứa cắn Iml Ethanol 90®, lắc cho hòa tan hết cắn, thêm thuốc thử Baljet vừa mới chuẩn bị (1 phần acid picric 1%- 9 phần NaOH 10%).
Kết quả: đd thử không chuyển màu (Phản ứng âm tính)
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn thử 2ml Ethanol 90^. lắc đều cho cắn được hòa tan hết. Thêm vài giọt dd sắt (III) clorid 5% pha ưong acid acetic. Lắc đều, nghiêng ống nghiệm 45®.
Thêm đồng lượng acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm.
Kết quả: ở mặt tiếp xúc giữa hai chất lỏng không có vòng màu tím đỏ, lắc nhẹ ống nghiệm lớp chất lỏng phía trên không có màu xanh (Phản ứng âm tính)
Nhận xét: qua kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu không có glycosid tim.
5*^ Đinh tính Flavonoid
Lấy 5g bột dược liệu, cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml cồn 90®, đun sôị trong vài phút, lọc nóng. Dịch lọc đem tiến hành các phản ứng:
Phản ứng Cyanìdin
Cho vào ống nghiệm nhỏ Iml dịch chiết, thêm ít bột Mg, vài giọt HCl đặc. Để yên vài phút.
Kết quả: dung dịch không chuyển màu (Phản ứng âm tính).
Phản ứng với NHị
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, hơ khô, để lên miệng lọ NH3 đã được mở nút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả: màu vàng không tăng lên (Phản ứng âm tính). - Phản ứng với thuốc thử F e d3
Cho vào ống nghiêm Iml dịch chiết, thêm 1 giọt FeClj.
Kết quả: không thấy xuất hiện màu xanh đen (Phản ứng âm tính).
N h ậ n xét. qua các phản ứng trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu
không có fiavonoid.
> Đinh tính Anthrasỉycosid - Phàn ứng Borntrager
Lấy 2g bột dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 15 ml H2SO4 10%. Đun cách thủy 15 phút, lọc, chuyển dịch lọc vào bình gạn, lắc với 5- 7ml ether ethylic trong 1- 2 phút, để yên cho phân thành 2 lớp, loại phần nước, cho vào phần ether ethylic 5ml NaOH 10%, lắc, thấy lớp ether ethylic có màu vàng nhạt, lófp kiềm không màu (Phẩn ứng âm tính).
Vi thăng hoa
Cho vào nút chai nhôm một ít bột dược liệu, đun nhẹ để bay hơi hết nước. Đậy một phiến kính trên có đặt miếng bông tẩm nước lạnh. Lấy phiến kính ra, đem soi kính hiển vi.
Kết quả: không thấy tinh thể hình kim màu vàng (Phản ứng âm tính).
ĩỉh ậ n x é t từ các phản ứng trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu không có anthraglycosid.
> Đinh tính Coumarin
Lấy 5g bột dược liệu cho vào cốc, thêm 50ml cồn 90°. Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu được đùng làm các phản ứng:
Phản ứng mở- đóng vòng lacton
Cho vào hai ống nghiệm, mỗi ống Im l dịch chiết, ống thứ nhất thêm 0,5 ml NaOH 10%, ống thứ hai để nguyên. Đun cả hai ống đến sồi, để nguội và quan sát thấy: ống 1 vàng đục, ống 2 dịch trong.
Thêm vào cả hai ống nghiệm 2 ml nước, ỉắc thấy ống 1 trong, ống 2 đục.
Acid hóa ống 1 bằng HCl đặc thấy ống 1 đục như ống 2 (Phản ứng dương tính).
Vi thăng hoa
Cho vào nắp chai nhôm ít bột dược liệu, đun nhẹ, để bay hơi hết nước. Đậy phiến kính ưên để 1 miếng bông ướt. Lấy phiến kính ra, nhỏ 1 giọt KI
10%. Soi dưới kính hiển vi.
Phản ứng Diazo
Lấy Iml dịch cồn, thêm vào 2ml NaOH 10%, đun cách thủy đến sôi, để nguội, thêm vài giọt thuốc thử Diazo vừa mới pha.
Kết quả: màu chuyển từ vàng sang đỏ (Phanả ứng dương tính).
N hận xét: qua nhũng kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu có Coumarin.
> Định tính saponin Hiện tượng tạo bọt
Cho vào ống nghiệm to một ít bột dược liệu, thêm khoảng 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên trong 15 phút, thấy có cột bọt bền vững.
Sơ bộ phân biệt 2 loại saponin triterpenoid và saponin steroid
Cho vào ống nghiệm to 2,0 g bột dược liệu, thêm 20 ml cồn 90®, đun sôi, lọc. Dịch lọc tiến hành làm thí nghiệm như bảng 2.1:
Bảng 2.1. Thí nghiệm phân biệt saponin triterpenoid và saponin steroid
Ong 1 Ong 2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dịch chiết (ml) 5 ml 5 ml
Dung dịch NaOH 0,1 N 5 ml
Dung dịch HCl o .l N 5 ml
Lắc dọc theo ống nghiệm trong 1 phút: ống 1 có cột bọt cao hom ống 2.
Phản ứng Libermann- Bouchardat
Lấy Im l dịch chiết MeOH , cô cách thủy đến cắn, hòa tan trong 1 ml
anhydrid acetic, đun nóng. Thêm từ từ Iml H2SO4 đặc theo chiều dọc của ống
nghiệm, thấy xuất hiện một vòng/n â u ^ ^ iữa bề mặt phân cách 2 chất lỏng (Phản ứng dưcfng tính).
Cho vào ống nghiêm 1 ml dịch chiết MeOH, thêm 1 ml aciđ Tricloacetic, đun cách thủy khoảng 5 phút, thấy dung dịch chuyển từ vàng sang đỏ (Phản ứng dưcíng tính).
ỉ^hận xét: qua các kết quả trên có thể sơ bộ kết luận trong dược ỉiệu có
saponin Steroid.
Đinh tính Tanin
Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 20 ml nước cất, đun sôi, lọc. Dịch lọc đem
làm các phản ứng:
Phản ứng với PeCỈỊ
Lấy 2 ml dịch lọc, cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt FeClg 5%, xuất hiện màu xanh đen (Phản ứng dương tính).
Phản ứng với dung dịch geỉaũn 1%
Cho vào ống nghiệm nhỏ 2 ml dịch chiết, thêm 1 giọt gelatin 1%,
không thấy xuất hiện tủa bông trắng (Phản ứng âm tính).
Nhận xét: từ các kết quả trên có thể sơ bộ kết luân trong dược liệu
không có tanin.
> Đinh tính acid hữu cơ
Lấy 1 g bột dược ỉiệu, thêm 5 ml nước cất, đun sôi trong vài phút, lọc. Lấy 3 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài tinh thể Na2C03 thấy có
một ít bọt khí nhỏ nổi lên.
N hận xét: có thể sơ bộ kết luận trong được liệu có acid hữu cơ. ^ Đinh tính đườne khử tư do
Lấy khoảng 2 g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5 ml cồn 90“,
đun cách thủy 10 phút, lọc lấy dịch. ƠĨO 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm
0,5 ml thuốc thử Fehling A và 0,5 ml thuốc thử Fehling B. Đun cách thủy vài phút thấy có tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm.
N hận xét: có thé sơ bộ kết luận trong dược liệu có đường khử. > Đỉnh tính chất béo, caroten. steroỉ
Định tính chất béo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 5 g được liệu vào bình nón có nút mài, thêm ether dầu hỏa ngập bội dược liệu, đun cách thủy 10 phút, lọc. Nhỏ 1 giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi. Không thấy để lại vết mờ trên giấy lọc.
N hận xét: có thể sơ bộ kết luận dược liệu không có chất béo.
Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm to 2 ml dịch chiết ether đầu hỏa, bốc hơi trên nồi
cách thủy đến cắn, thêm vài giọt H2SO4 đặc vào cắn, thấy dịch lỏng không có
màu.
N hận xét: có thể sơ bộ kết luận dược liệu không có caroten.
Định tính steroỉ
Q io vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. thêm vào ống nghiệm ỉ ml anhydrid acetic, lắc kĩ cho tan hết cắn. Để ống nghiêm nghiêng 45*^, thêm từ từ H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh.
N hận xét: có thể sơ bộ kết luận trong dược liệu có sterol.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong thân mộc thông ta được trình bày tóm tắt theo bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả định tính các nhóm chất trong thân cây mộc thông
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận Phản ứng với các TT Mayer + 1 Alcaloid Dragendorff + Có Bouchardat + Acid picric 1% + Phản ứng Baijet -
2 Glycosid tim Phản ứng Libermann + Không
3 Flavonoid Phản ứng Cyanidin Phản ứng với NH, Phản ứng với FeCl, - Không có 4 Anthraglycosid Phản ứng Bomtrager Vi thăng hoa - Không có 5 Coumarin Phản ứng mở vòng lacton Vi thăng hoa Phản ứng Diazo + + Có 6 Saponin
Hiện tượng tạo bọt
Phản ứng Liberman- Bouchardat Phản ứng Hirchshon + + + Có
7 Tanin Phản ứng với FeClg
Phản ứng với dd gelatin 1%
+
Không
8 Aciđ hữu cơ Phản ứng với Na2CƠ3 + Có
9 Đường khử tdo Phản ứng vdi TT Fehling A và
Fehling B + Có
10 Chất béo Tạo vết mờ trên giấy - Không có
11 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không có
12 Sterol Phản ứng Libermann + Có
N hận xét', trong tíiân cây mộc thông ta có alcaloid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, đường khử và sterol; không có flavonoid, antranoid, glycosid tim.
2.2.2.3. Nghiên cứu về saponin y ỵâc đinh chỉ số b o t
Cân lOg bột dược liệu, cho vào bình nón có đung tích 500mi đã chứa sẵn 100 ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ ừong 30 phút. E)ể nguội, lọc, thêm nước cho đủ 100 ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lấy 10 ống nghiệm chiều cao 16 cm, đường kình 16 mm, cho vào các ống nghiệm đó lần lượt 1, 2, 3, 10 ml địch chiết, thêm nước cất vào mỗi Ống cho đủ 10 mi. Lắc mạnh các ống nghiệm theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây 2 lần lắc. Để yên 15 phút rồi đo chiều cao của các cột bọt. Cách tiến hành thí nghiệm ghi ở bảng 2.3. Bảng 2.3. Thí nghỉệm xác định CSB Ong 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dịch chiết saponin (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nước cất (ml) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 Thể tích 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Q iỉ số bọt được tính theo công thức:
10x1 CSB = h x C Với: h; ống có cột bọt cao 1 cm C: nồng độ nước sắc
Kết quả; ống số 6 có cột bọt cao 1 cm. Vậy chỉ số bọt của dược liệu là:
10x1
CSB -
6x0,10 = 17
^ Xác đinh chỉ s ố phá huyết " Chuẩn bị:
Dung dịch nước muối sinh lí 0,9%. Pha dung treo máu 2%
Lấy 5ml máu thỏ cho vào một ống nghiệm chứa sẵn 0,5 mỉ Natri citrat 3,65%, li tâm, bỏ phần huyết tưcfng, lấy phần hồng cầu. Rửa sạch phẩn hồng
cầu bằng dung dịch NaCl 0,9%, thêm dung dịch NaCl 0,9% vào hồng cẩu đã li tâm cho đủ 5 ml. Hút 2 ml cho vào bình định mức 100 ml, thêm NaCỈ 0,9% đến vạch, lắc đều.
Pha dung dịch saponin
Cân chính xác khoảng Ig bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 250 ml, thêm 100 ml NaCl 0,9% vừa đun sôi. Lắc kĩ. Đun cách thủy sôi trong 30 phút. Lọc nóng qua bông vào trong cốc có mỏ. Để nguội, chuyển dịch chiết vào trong bình định mức 100,00 ml. Thêm NaCl 0,9% vừa đủ đến vạch, lắc đều.
■ Thử sơ bộ
Pha các hỗn hợp theo bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thí nghiêm sơ bộ xác định chỉ số phá huyết
Ong I II ni IV
Dịch chiết dược liệu (ml) 0,10 0,20 0,50 1,00
Dung dịch đệm (ml) 0,90 0,80 0,50 0,00
Dung treo máu 2% (ml) 1,00 1,00 1,00 1,00
Thể tích 2,00 2,00 2,00 2,00
Lắc nhẹ ngay hỗn hợp (tránh tạo bọt). Sau 30 phút lắc lại một lần nữa để yên trong 6 giờ ở nhiệt độ phòng. Quan sát các ống và xác định ống (hoặc các Ống) có hiện tượng phá huyết hoàn toàn.
Cách điều chỉnh nồng độ dịch chiết dược liệu để xác định CSPH được ghi ở bảng 2.5.
Bảng 2.5.Cách điều chỉnh nồng độ dịch chiết dược liệu để xác định CSPH
Ống II III IV Cách điều chỉnh nồng độ dịch chiết
Hiện tượng phá huyết + + + + + + + + +
Dùng lượng dược liệu ban đầu Pha loãng gấp đôi
Pha loãng gấp 5 Pha loãng gấp 10
Thử với địch chiết đậm đạc hcfn
Ghi chú: (“): Không có hiện tượng phá huyết. (+): Có hiện tượng phá huyết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi thay đổi dịch chiết dược liệu, làm lại thí nghiệm sơ bộ từ đầu để xác định lượng dược liệu thích hợp cho thí nghiệm.
K ết quả: Nhiều lần thử cho thấy với dung dịch 15% ống IV có hiện tượng phá huyết hoàn toàn. Do vậy, dùng dịch chiết dược liệu 15% để xác định CSPH.
■ Thí nghiệm chính thức
Lấy 20 ống nghiệm nhỏ, đánh số thứ tự từ 1 đến 20 và cho vào mỗi ống lần lượt các dung dịch theo bảng 2.6.
Bảng 2.6. T hí nghiệm xác định chỉ số p h á huyết
Ống Dd NaCl 0,9% Dd mộc thông^-%) Dd máu 2% đã loại fibrin
1 0,95 0,05 1,00 2 0,90 0,10 1,00 3 0,85 0,15 1,00 4 0,80 0,20 1,00 5 0,75 0,25 1,00 6 0,70 0,30 1,00 7 0,65 035 1,00
10 T T 12 l y 14 U ' 16 I T ~ w l ữ 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 ~Õ JĨ 0,10 0,05 1,00 0,50 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 ~ Õ ^ 0,00 1,00 T7ÕÕ 1,00 1,00 ĩ7oo 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Sau khi pha, lắc nhẹ ống nghiệm để trộn đều (tránh tạo bọt). Sau 30 phút lắc lại một lần nữa. Sau 24 giờ đọc kết quả. Tìm ống nghiệm đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn.
Chỉ số phá huyết được tính theo công thức:
2
C x X Với;
CSPH: chỉ số phá huyết
c : nồng độ đung dịch dược liệu
X : số ml dung dịch dược liệu cho vào ống nghiệm mà ở đó gây ra hiện tượng phá huyết đầu tiên và hoàn toàn.
Kết quả: ống số 16 là ống đầu tiên có hiện tượng phá huyết hoàn toàn. Vậy, CSPH là:
2
CSPH =
^ Đinh ỉươns Saữonin toàn phần • Chiết xuất
Cân chính xác khoảng 15 g bột dược liệu, chiết Soxhỉet với ether dầu hỏa trong 8 giờ đé loại tạp. Để dược liệu khồ tự nhiên, chiết tiếp bằng Methanol 80% trong 12 giờ. Dịch chiết thu được cất thu hồi MeOH, cao lỏng còn lại pha loãng bầng nước nóng, để nguội, lọc loại các tạp chất không tan. Dịch thu được lác vói ether dầu hỏa 2 lần, bốc hoi cho hết ether dầu. Lắc với n- Butanol nhiều lần đến khi lớp n- Butanol trong, tíiu hồi n- Butanol được cắn. Hòa tan cắn trong một lượng tối thiểu MeOH, thêm từ từ một lượng aceton gấp khoảng 10 lần, saponin kết tủa Để lắng, lọc thu lấy tủa. Dịch lọc cho ứiêm lượng aceton khác vào để kết tủa hết saponin. Gộp các tủa lại.