Dụng cụ và thiết bị
Găng tay, lọ nhựa đựng mẫu, viết đánh dấu, viết chì, giấy, dây thun , phiến kính, thƣớc đo, kính lúp, kính hiển vi, thƣớc trắc vi vật kính, thƣớc trắc vi thị kính, máy chụp ảnh.
Hóa chất: nƣớc cất; cồn 700
.
18
Hình 10. Kính hiển vi 3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Mẫu sán bảo quản trong dung dịch cồn 70o
đƣợc tiến hành định danh phân loại qua các trình tự sau
3.3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu
Sau khi bò đƣợc giết mổ, tiến hành kiểm tra và thu thập mẫu ký sinh trùng trên cơ thể và khí quan bằng phƣơng pháp mổ khám từng phần của viện sĩ Skrjabin.
Thu thập mẫu. Kiểm tra hệ tiêu hóa
Thực quản: cắt theo chiều dọc.
Dạ dày: lấy chất chứa trong dạ dày ra ngoài, rửa sạch bằng nƣớc kiểm tra và thu thập giun sán.
Ruột: tách riêng ruột non và ruột già, lấy chất chứa bên trong ra xô gạn rửa sa lắng nhiều lần qua nƣớc tìm giun sán ký sinh.
Gan: căt dọc theo tĩnh mạch gan, dùng 2 tay nặn 2 mép cắt để tìm sán lá gan.
Mật: cắt ống dẫn mật và mổ túi mật cho vào cốc để bắt sán ra.
Các mẫu sán đƣợc bảo quản trong cồn cồn 700, đánh dấu các lọ đựng rồi đem về phòng thí nghiệm.
3.3.3.2. Phương pháp đo sán lá gan
Phương pháp đo bằng thước đo Mititoyo Dial Caliper
Sán đựng trong lọ đƣợc đánh dấu đƣợc vớt ra đặt lên phiến kính.
Đặt lên 2 đầu phiến kính 2 miếng giấy dày bằng một phần chiều dày của con sán.
Sau đó đặt phiến kính khác lên phiến kính có mẫu sán và cột 2 đầu bằng dây thun để cố định mẫu.
19
Dùng thƣớc Mititoyo Dial Caliper đo chiều dài và chiều rộng của mẫu sán. Sau khi đo kích thƣớc mẫu sán ta đặt mẫu sán đã cố định vào chậu cồn 70o
để mẫu sán không bị hỏng
Cho cồn phủ mẫu và để yên 1 – 2 ngày.
Tháo dây cột và phiến kính. Sau đó nhỏ lên mẫu dung dịch glycerin 50% (tỷ lệ glycerin : nƣớc cất là 1:1) lên tiêu bản mẫu, đậy lên đó lá kính để yên 2 – 3 ngày.
Đƣa tiêu bản đã có dung dịch glycerin lên kính lúp để xem tổng thể, để xem chi tiết cấu tạo bên trong ta đƣa lên kính hiển vi xem dƣới độ phóng đại 40 lần (X4) để định danh.
Hình 11. Cố định và tiến hành đo sán
20
Phương pháp đo trắc vi
Quan sát và đo đƣờng kính giác bụng, giác miệng sán lá gan dƣới kính hiển vi ở vật kính 4X.
Mô tả thước đo
Thƣớc trắc vi thị kính là một miếng kính hình tròn ở chính giữa có một thƣớc nhỏ 5 mm đƣợc chia thành 100 phần bằng nhau và đƣợc đánh số từ 0 100.
Thƣớc trắc vi vật kính là một tấm thuỷ tinh, ở giữa có một thƣớc nhỏ 1mm đƣợc chia thành 100 khoảng đều nhau, vì vậy mỗi khoảng chia là 0,01mm hay 10 µm.
Xác định giá trị mỗi khoảng của thước đo thị kính
Để xác định giá trị mỗi khoảng của thƣớc đo thị kính đối với một độ phóng đại ta làm nhƣ sau:
Đặt thƣớc trắc vi vật kính vào bàn kính, điều khiển cho thấy ảnh rõ của thƣớc.
Xê dịch thƣớc trắc vi vật kính và xoay thƣớc trắc vi thi kính sao cho 2 thƣớc song song và gần sát vào nhau, tiếp tục xê dich thƣớc trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thƣớc trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thƣớc trắc vi thị kính, và 1 vạch thứ 2 nào đó của thƣớc trắc vi vật kính trùng với thƣớc trắc vi thị kính (Hình 15).
Đếm số khoảng cách của thƣớc trắc vi thị kính trùng với thƣớc trắc vi vật kính. Ta có trị số một khoảng cách của thƣớc trắc vi thị kính (x) theo công thức:
Trong đó: x trị số 1 khoảng của thƣớc trắc vi thị kính N là số khoảng của thƣớc trắc vi vật kính, N=10 N x = * 10µm n (A) (B) Hình 13. Thƣớc đo trắc vi (A) thƣớc đo thị kính (B) thƣớc đo vật kính
21
n là số khoảng của thƣớc trắc vi thị kính, n=4 Nhƣ vậy:
Mô tả cách đo
Tiến hành đo kích thƣớc theo trình tự sau:
Thay thƣớc trắc vi vật kính bằng mẫu sán, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của mẫu.
Di chuyển mẫu thế nào cho một đầu của mẫu đo trùng với 1 vạch của thƣớc trắc vi thị kính, từ đó tìm 1 vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng trắc vi nằm trong 2 vạch này rồi suy ra kích thƣớc mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng nhân với trị số 1 khoảng cách của thƣớc trắc vi thị.
Hình 15. Dùng thƣớc trắc vi đo đƣờng kính giác bụng, giác miệng của sán
Thƣớc đo thị kính
Thƣớc đo vật kính (1mm ÷ 100 khoảng; 0,01mm)
Hình 14. Thƣớc đo thị kính (trên) và vật kính (dƣới) nhìn dƣới kính hiển vi quang học
10
x = * 10µm = 25 µm = 0,025 mm 4
22
Hình 16. Hình ảnh giác miệng và giác bụng quan sát dƣới kính hiển vi
Phương pháp định danh phân loại
Việc phân loại định danh đƣợc dựa vào tài liệu có hình ảnh của Nguyễn Thị Lê (2000), Craig và Faust’s (1970) căn cứ vào sự khác biệt của chiều dài, chiều rộng, giác miệng, giác bụng, tinh hoàn, tử cung, manh tràng, tuyến noãn hoàng, cấu tạo về hình thái, vị trí của từng bộ phận cơ thể.
3.3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc tính toán qua phƣơng pháp thống kê sinh học thực hiện trên máy tính theo chƣơng trình Microsoft Excel.
Cách tính
= số sán trung bình/1 cá thể bò
min – max
Tần số xuất hiện kiểu hình sán lá = số sán của 1 loại kiểu hình/tổng số sán lá thu thập đƣợc trên một tỉnh
Trong đó
min là số sán nhiễm thấp nhất
23
CHƢƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. CƢỜNG ĐỘ NHIỄM SÁN LÁ GAN Ở BÕ TẠI MỘT SỐ TỈNH
ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG QUA PHƢƠNG PHÁP MỔ KHÁM
Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên 88 bò nhiễm sán qua mổ khám đƣợc thể hiện qua bảng 4 nhƣ sau:
Bảng 4. Số lƣợng sán lá gan ký sinh trên một cá thể bò tại một số tỉnh ĐBSCL
Tỉnh Số bò nhiễm (con) Tổng số sán lá gan (con) Số sán/1 cá thể bò (min - max) Số sán /cá thể (TB ± SE) A 20 121 1 – 12 6,050 ± 0,316 B 31 191 5 – 10 6,161 ± 0,107 C 16 75 3 – 5 4,688 ± 0,070 D 9 18 1 – 5 2,000 ± 0,312 E 12 51 3 – 8 4,250 ± 0,216 Tổng 88 456 1 – 12 5,182 ± 0,253 Nhận xét:
Qua bảng 4, có thể thấy trên một cá thể bò nhiễm từ 1 – 12 con sán/cá thể cụ thể nhƣ sau
Cƣờng độ nhiễm trên một bò bị nhiễm sán lá dao động từ 2,000 ± 0,312 con/cá thể đến 6,161 ± 0,107 con/cá thể. Trong đó, ta thấy tỉnh A và tỉnh B có cƣờng độ nhiễm cao (tỉnh A có cƣờng độ nhiễm là 6,050 ± 0,316 con/cá thể, tỉnh B có cƣờng độ nhiễm là 6,161 ± 0,107 con/cá thể), mẫu D có cƣờng độ nhiễm thấp nhất (2,000 ± 0,312 con/cá thể). Cƣờng độ nhiễm khác nhau có thể do việc chăm sóc nuôi dƣỡng hoặc bò đƣợc nuôi dƣỡng tại những nơi có ký chủ trung gian khác nhau.
4.2. THÀNH PHẦN CÁC KIỂU HÌNH SÁN LÁ GAN LỚN KÝ SINH
Ở BÕ TẠI ĐBSCL
4.2.1. Đặc điểm hình thái của một số kiểu hình sán lá gan lớn tại 5 tỉnh ĐBSCL ĐBSCL
Đề tài tiến hành định loại 456 mẫu sán lá gan bò thu thập tại 5 tỉnh ĐBSCL. Sau khi tiến hành phân loại, chúng tôi định dạng đƣợc 5 kiểu hình sán lá gan lớn bao gồm F1, F2, F3, F4 và F5 với các dạng kiểu hình và kích thƣớc khác nhau thể hiện qua bảng 5
24
Bảng 5. Đặc điểm hình thái của kiểu hình sán lá gan lớn tại một số tỉnh ĐBSCL
ĐĐHT SL Chiều dài (mm) Chiều rộng (mm) Giác miệng (mm) Giác bụng (mm) Tỷ lệ dài/rộng F1 53 30,509 ± 0,482 9,926 ± 0,102 1,010 ± 0,114 1,333 ± 0,056 3,079 ± 0,045 F2 1 30,570 11,100 1,125 1,425 2,754 F3 152 27,367 ± 0,340 10,104 ± 0,096 1,011 ± 0,011 1,286 ± 0,008 2,720 ± 0,030 F4 222 33,176 ± 0,339 9,902 ± 0,107 1,062 ± 0,007 1.290 ± 0,007 3,380 ± 0,029 F5 28 36.129 ± 1.161 6,438 ± 0,288 0,960 ± 0,040 1,248 ± 0,022 4,215 ± 0,105 Tổng 456 31,101 ± 0,257 9,898 ± 0,067 1,040 ± 0,005 1,294 ± 0,005 3,174 ± 0,027
Chú thích: F1, F2, F3, F4, F5 là ký hiệu các kiểu hình sán lá gan lớn được đánh dấu từ 1 đến 5 SL đơn vị: con
25
Kích thƣớc các chiều đo, các kiểu hình sán lá biến động từ 27,367 ± 0,340 (mm) đến 36,129 ± 1,161 (mm) đối với chiều dài và từ 6,438 ± 0,288 (mm) đến 11,110 (mm) đối với chiều rộng, tỷ lệ dài/rộng dao động từ 2,720 ± 0,030 (mm) đến 4,215 ± 0,105 (mm). Trong đó:
Kiểu hình dạng 5 (F5) có kích thƣớc lớn nhất với kích thƣớc là 36,129 ± 1,161 (mm) x 6,438 ± 0,288 (mm), tỷ lệ dài/rộng là 4,215 ± 0,105.
Kế tiếp là kiểu hình dạng 4 (F4) với kích thƣớc là 33,176 ± 0,339 (mm) x 9,902 ± 0,107 (mm), tỷ lệ dài/rộng là 3,380 ± 0,029, tuy kiểu hình F4 có chiều rộng lớn hơn so với kiểu hình F5 nhƣng chiều dài và tỷ lệ dài/rộngđối với F5 có cao hơn F4.
Kiểu hình dạng F1 với kích thƣớc là 30,509 ± 0,482 (mm) x 9,902 ± 0,102 (mm), tỷ lệ dài/rộng là 3,079 ± 0,045; kiểu hình F1 có chiều rộng tƣơng dƣơng kiểu hình F4 (9,902 ± 0,102 (mm)) nhƣng chiều dài lại nhỏ hơn, tỷ lệ dài/rộng cũng nhỏ hơn.
Kiểu hình F2 có kích thƣớc 30,570 (mm) x 11,100(mm), tỷ lệ dài/rộng là 2,754.
Ta lại thấy kiểu hình có kích thƣớc nhỏ nhất là F3 với kích thƣớc 27.367 ± 0.340 (mm) x 10.104 ± 0.096 (mm), tỷ lệ dài/rộng là 2,720 ± 0,030.
Nhận xét một cách tổng quát, giá trị trung bình của giác bụng và giác miệng tƣơng đối đồng đều. Giác miệng nhỏ hơn giác bụng dao động trong khoảng 1,040 ± 0,005 (mm); giác bụng dao động trong khoảng 1,294 ± 0,005 (mm):
Kiểu hình F1 có giác miệng 1,010 ± 0,114 (mm), giác bụng 1,333 ± 0,056 (mm). Kiểu hình F2 giác miệng 1,125 (mm), giác bụng 1,425 (mm). Kiểu hình F3 có giác miệng 1,011 ± 0,011 (mm), giác bụng 1,286 ± 0,008 (mm). F4 có giác miệng 1,062 ± 0,007 (mm), giác bụng 1.290 ± 0,007 (mm). F5 có giác miệng 0,960 ± 0,040 (mm), giác bụng 1,248 ± 0,022 (mm)).
Từ các kết quả trên, ta thấy các số liệu về kích thƣớc có hƣớng nghi ngờ là sán lá gan F.gigantica.
Đặc điểm hình thái của 5 dạng sán lá được phân loại
Sau khi đo các kích thƣớc cần thƣớc, chúng tôi tiến hành đánh giá hình thái bên ngoài dựa vào đặc điểm tổng quan của sán, đƣợc mô tả kiểu hình của 5 dạng sán nhƣ sau:
26
(a)Kiểu hình F1
Hình 17. Kiểu hình sán lá gan dạng 1 (F1)
Hình dáng giống nhƣ chiếc lá, dài 21,670 – 37,205 mm, rộng 8,310 – 12,200 mm. Đa số chiều dài gấp 3 lần chiều rộng. Đầu sán có chóp, hình nón, thƣờng có màu xám, có vai (thấy rõ). Hai rìa bên thân song song nhau, phần cuối thân kín lại. Chúng có giác miệng và giác bụng. Các giác bụng tròn lớn lồi ra, giác miệng nhỏ ở ngay đỉnh đầu, đƣờng kính giác miệng và giác bụng lần lƣợt là 0,750 – 1,250 mm, 1,125 – 1,675 mm.
Buồng trứng phân thành nhiều nhánh nằm gần giữa trƣớc thân, tuyến noãn hoàn xếp dọc 2 bên thân phủ khắp, tạo chóp nhọn ở gốc đuôi. Hai tinh hoàn phân nhánh nằm chồng lên nhau.
(b)Kiểu hình dạng F2
Hình 18. Kiểu hình sán lá gan dạng 2 (F2)
Thân có dạng hình chữ nhật (suông từ phần đầu đến đuôi), dài 30,570 mm, rộng 11,100 mm. Đầu sán có chóp, hình nón, thƣờng có màu xám, không vai. Hai rìa bên thân song song nhau, phần cuối thân kín lại, tù (dẹt). Chúng có giác miệng
27
và giác bụng. Các giác bụng tròn lớn lồi ra, giác miệng nhỏ ở ngay đỉnh đầu, đƣờng kính giác miệng và giác bụng lần lƣợt là 1,125 mm, 1,425 mm.
Buồng trứng phân thành nhiều nhánh nằm gần giữa trƣớc thân, tuyến noãn hoàn xếp dọc 2 bên thân, phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa, tạo chóp nhọn ở gần gốc đuôi. Hai tinh hoàn phân nhánh nằm chồng lên nhau.
(c) Kiểu hình dạng F3
Hình 19. Kiểu hình sán lá gan dạng 3 (F3)
Hình dáng giống nhƣ chiếc lá, dài 11,000 – 44,955 mm, rộng 6,640 – 15,560 mm. Đầu sán có chóp, hình nón, thƣờng có màu xám, không vai. Hai rìa bên thân song song nhau (2 rìa thân không song song hẳn), phần cuối thân kín lại. Chúng có giác miệng và giác bụng. Các giác bụng tròn lớn lồi ra, giác miệng nhỏ ở ngay đỉnh đầu, đƣờng kính giác miệng và giác bụng lần lƣợt là 0,700 – 1,375 mm, 1,000 – 1,650 mm.
Buồng trứng phân thành nhiều nhánh nằm gần giữa trƣớc thân, tuyến noãn hoàn xếp dọc 2 bên thân, phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa. Hai tinh hoàn phân nhánh nằm chồng lên nhau.
(d)Kiểu hình dạng F4
28
Hình dáng giống nhƣ chiếc lá, dài 18,840 – 44,975 mm, rộng 6,115 – 14,430 mm. Đầu sán có chóp, hình nón, thƣờng có màu xám, có vai. Hai rìa bên thân song song nhau (2 rìa thân không song song hẳn), phần cuối thân kín lại. Chúng có giác miệng và giác bụng. Các giác bụng tròn lớn lồi ra, giác miệng nhỏ ở ngay đỉnh đầu, đƣờng kính giác miệng và giác bụng lần lƣợt là 0,700 – 1,250 mm, 1,000 – 1,625 mm.
Buồng trứng phân thành nhiều nhánh nằm gần giữa trƣớc thân, tuyến noãn hoàng ít, xếp dọc 2 bên thân, không phủ khắp phần thân sau của sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa, tạo chóp nhọn (sâu) ở gần gốc đuôi. Hai tinh hoàn phân nhánh nằm chồng lên nhau.
(e)Kiểu hình dạng F5
Hình 21. Kiểu hình sán lá gan dạng 5 (F5)
Thân sán thon dài, dài 23,430 – 47,230 mm, rộng 4,970 – 11,640 mm. Đầu sán có chóp, hình nón, thƣờng có màu xám, có vai. Hai rìa bên thân song song nhau, phần cuối thân kín lại. Chúng có giác miệng và giác bụng. Các giác bụng tròn lớn lồi ra, giác miệng nhỏ ở ngay đỉnh đầu. đƣờng kính giác miệng và giác bụng lần lƣợt là 0,725 – 1,200 mm, 1,000 – 1,600 mm.
Buồng trứng phân thành nhiều nhánh nằm gần giữa trƣớc thân, tuyến noãn hoàng dọc theo cơ thể, phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa, tạo chóp nhọn gần gốc đuôi. Hai tinh hoàn phân nhánh nằm chồng lên nhau.
29
Bảng 6. Tóm tắt đặc điểm hình thái một số kiểu hình sán tại một số tỉnh ĐBSCL
Kiểu hình Đặc điểm hình thái
F1 Cơ thể dài, tỷ lệ dài chia rộng 3,08
Đƣờng kính giác miệng là 1,050 mm; giác bụng là 1,333 mm
Ruột phân nhánh
Phần đầu hình nón, tạo vai
Phần đuôi tù
2 mép thân song song
Tuyến noãn hoàng phủ khắp, tạo chóp nhọn ở gốc đuôi F2 Cơ thể hơi dài, tỷ lệ dài/rộng 2,75
Đƣờng kính giác miệng là 1,125 mm; giác bụng là 1,425 mm
Ruột phân nhánh
Phần đầu hình nón, không có vai
Phần đuôi tù nhiều (dẹt)
2 mép thân song song
Tuyến noãn hoàng phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa, tạo chóp nhọn ở gần gốc đuôi.
F3 Cơ thể hơi dài, tỷ lệ dài/rộng 2,72
Đƣờng kính giác miệng là 1,011 mm; giác bụng là 1,286 mm
Ruột phân nhánh
Phần đầu hình nón, không có vai
Phần đuôi tù
2 mép thân song song
Tuyến noãn hoàng phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ) ở giữa.
F4 Cơ thể dài, tỷ lệ dài/rộng 3,38
Đƣờng kính giác miệng là 1,062 mm; giác bụng là 1,296 mm
Ruột phân nhánh
Phần đầu hình nón, hơi tạo vai hoặc không có hẳn
Phần đuôi nhọn
2 mép thân song song
Tuyến noãn hoàng ít, không phủ khắp phần thân sau của sán, tạo 1 đƣờng
F1 F2 F3 F4 F5
30
kẻ (nhỏ) ở giữa, tạo chóp nhọn (sâu) ở gần gốc đuôi.
F5 Cơ thể rất dài (dài nhất trong 5 kiểu hình), tỷ lệ dài/rộng 4,22
Đƣờng kính giác miệng là 0,996 mm; giác bụng là 1,248 mm
Ruột phân nhánh
Phần đầu hình nón, tạo vai
Phần đuôi nhọn
2 mép thân song song
Tuyến noãn hoàng phủ khắp, chiếm gần ½ thân sán, tạo 1 đƣờng kẻ (nhỏ)