Chủng Streptomyces 13.312 được nuôi cấy trên các môi trường ISP kết quả được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2: So sánh đặc điểm của Streptomyces 13312 với Streptomyces gríseosporeus
Các đặc điểm phân loại Streptomyces 13.312 Streptomyces griseosporeus
Màu khuẩn ty khí sinh WGỵ
tM
Gy
Sắc tố melanin 1 1
Màu khuẩn ty cơ chất 0 0
Sắc tố hoà tan 0 0 Chuỗi bào tử RA RA Bề mặt bào tử Sm Sm arabinose + + Xylose ± + Inositol + + Mannitol + + Fructose + + Rhamnose + + Saccarose ± + Raffinose + + Nhận xét:
Như vậy về căn bản kết luận Streptomyces 13.312 có tên Streptomyces griseosporeus.
2.2.2. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 13.312 trên môi trường phân lập(MT3)
Hoạt tính của kháng sinh do chủng Streptomyces 13.312 sinh tổng hợp trên MT3 được thử trên một số vsv kiểm định, kết quả được trình bày ở bảng3
Bảng 3: Hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces 13.312 trên một số v sv kiểm định
vsv kiểm định
BC BP BS SL sta EC Pro Pseu Shi Sal
Đường kính
vòng vô khuẩn 12,68 13,26 12,14 15,64 14,54 13,18 15,42 15,48 16,82 15,54
Nhận xét:
Sau khi thử trên nhiều chủng Streptomyces, quyết định chọn chủng
Streptomyces 13.312 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
2.2.3. Kết quả lựa chọn môi trường nuôi cấy và các vsv kiểm định của chủng Streptomyces 13.312
Đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 13.312 khi thay đổi môi trường để chọn môi trường tốt nhất cho quá trình nuôi cấy và lên men. Kết quả được trình bày ở bảng 4.
Bảng 4: Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 13.312 khi nuôi cấy bề mặt
\ M T v s v \ MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 MT7 BC D 11,32 11,77 12,01 0,00 10,23 0,00 9,07 s 0,13 0,31 0,10 0,00 0,47 0,00 0,21 BP D 13,32 12,48 13,59 0,00 10,50 0,00 9,76 s 0,46 0,45 0,59 0,00 0,09 0,00 0,33 BS D 11,56 11,93 12,25 0,00 11,35 0,00 10,05 s 0,26 0,10 0,31 0 , 0 0 0,27 0 , 0 0 0,37 SL D 13,73 14,77 15,33 0,00 12,40 0,00 11,07 s 0,13 0,14 0,27 0,00 0,76 0,00 0,57 Sta D 13,15 13,51 14,35 0 , 0 0 11,97 0 , 0 0 10,41 s 0,40 0 , 1 2 0,25 0 , 0 0 0 , 8 6 0 , 0 0 0,14 EC D 12,67 13,56 14,03 0 , 0 0 11,48 0,00 10,06 s 0,37 0,32 0,40 0,00 0,66 0,00 0,56 Pr D 14,25 14,69 15,12 0,00 13,51 0,00 12,99 s 0,45 0,24 0,07 0,00 0,35 0,00 0,96 Ps D 14,74 15,08 15,27 0,00 14,50 0,00 12,11 s 0,25 0,34 0,08 0 , 0 0 0,45 0 , 0 0 0,67 Sal D 13,55 14,24 15,70 0,00 11,78 0,00 9,16 s 0,76 0,41 0,37 0,00 0,32 0,00 1,10 Shi D 14,08 15,62 16,83 0,00 12,25 0,00 11,49 s 0,41 0,32 0,47 0 , 0 0 0,05 0 , 0 0 0 , 2 1
Nhận xét:
- Streptomyces 13.312 không sinh tổng hợp kháng sinh trên MT4, MT6. Các nghiên cứu tiếp theo không chọn các môi trường này.
- Trên MT5, MT7 Streptomyes 13.312 cho hoạt tính kháng sinh yếu.
- Streptomycesl3.312 phát triển tốt và cho hoạt tính kháng sinh mạnh trên môi trường chứa c và N đặc thù (MT1, MT2, MT3). Trong đó MT3 là môi trường Streptomyces 13.312 sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất.
- Qua bảng trên, quyết định chọn 2 chủng vsv kiểm định là: Shigella ýỉexneri, Sarcina lutea vì với hai chủng này có hoạt tính kháng sinh ổn định, chọn
MT3 làm môi trường nuôi cấy chủng Streptomyces 13.312.
Sau khi nuôi cấy bề mặt chúng tôi tiến hành lên men trên máy lắc để khảo sát khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 13.312 trên các môi trường khác nhau. Đánh giá hoạt tính kháng sinh của dịch lọc sau lên men bằng phương pháp giếng thạch. Kết quả được trình bày ở bảng 5.
É
Bảng 5: Ảnh hưởng của các loại môi trường đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 13.312 khi lên men chìm.
Môi trường Hoạt lực kháng sinh SL Shi D (mm) s D(mm) s MT1 12,23 0,56 13,08 0,21 MT2 15,37 0,62 16,65 0,34 MT3 13,59 0,14 14,05 0,07 Nhận xét:
- MT3 là môi trường sinh tổng hợp kháng sinh mạnh nhất khi nuôi cấy bề mặt nhưng khi lên men chìm thì MT2 là môi trường cho kết quả tốt nhất.
Qua kết quả trên lựa chọn MT3 làm môi trường nuôi cấy bề mặt, MT2 làm môi trường lên men chìm.
2.2.4. Kết quả chọn chủng có hoạt tính cao bằng phép chọn lọc ngẫu nhiên
Tiến hành theo phương pháp chọn lọc ngẫu nhiên để chọn chủng có hoạt tính tốt nhất từ chủng gốc 13.312 để tiến hành nghiên cứu tiếp theo. Kết quả được trình bày ở bảng 6.
Bảng 6: Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên
Ký Kết quả Ký Kết quả
hiệu SL Shi hiệu SL Shi
biến chủng D (mm) s D (mm) s biến chủng D (mm) s D (mm) s 1 12,35 0,49 14,21 0,07 17 13,40 0,62 13,43 0,17 2 12,95 0,05 13,81 0,23 18 10,98 0,75 12,03 0,32 3 15,51 0,03 16,27 0,24 19 8,55 0,54 9,24 0,81 4 14,77 0,52 15,02 0,56 2 0 11,49 0,74 12,57 0 , 1 2 5 11,45 0,80 1 2 , 6 8 0,58 2 1 14,56 0,62 15,23 0,81 6 10,37 0 , 2 0 10,95 0,26 2 2 10,52 0,58 11,38 0,51 7 7,83 0,18 8,64 0,60 23 14,62 0,40 13,39 0,84 8 10,09 0,47 1 1 , 6 8 0,33 24 9,37 0,34 10,93 0,46 9 9,21 1 , 0 0 10,34 0,55 25 13,99 0,59 14,57 0,42 1 0 9,81 0,14 11,15 0,43 26 14,01 0,75 12,62 0,38 1 1 9,56 0 , 8 8 10,53 0,25 27 7,14 1,06 8,24 0,39 12 15,15 0,16 16,07 0,14 28 8,07 1,01 9,41 0,84 13 10,63 0,09 11,97 0,37 29 13,71 0,80 13,76 0,25 14 11,26 0,42 12,11 0,38 30 11,75 0,16 12,85 0,03 15 12,95 0,16 13,78 0,41 31 13,41 0,23 14,02 0,88 16 13,76 0,77 13,75 0,49 32 9,47 0,85 10,24 0.71
Nhận xét:Sau khi xử lý kết quả giữ lại các biến chủng 3, 12, 21 để tiến hành lên men chìm. Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối, được đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp giếng thạch, kết quả được giới thiệu ở bảng 7.
Bảng 7: Hoạt tính kháng sinh của các biến chủng 3,12, 21 sau sàng lọc ngẫu nhiên khi lên men chìm
Ký hiệu biến chủng SL Shi D (mm) s D (mm) s 3 14,04 0,54 16,86 0,47 12 16,03 0,15 17,24 0,55 21 13,86 1,02 15,10 0,81 Nhận xét: qua 2 bảng 6, 7 ta thấy:
-Dịch lọc sau lên men chìm của biến chủng 12 có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất. Trong các nghiên cứu tiếp theo sử dụng giống là biến chủng 12.
-Kết quả chọn lọc ngẫu nhiên chỉ có ý nghĩa ban đầu vì chủng có hoạt tính kháng sinh cao sau chọn lọc ngẫu nhiên cần được cải tạo tiếp
2.2.5. Kết quả đột biến bằng ánh sáng uv.
-Tiến hành đột biến Streptomyces 13.312 bằng ánh sáng uv thu được các kết quả sau:
- Độ sống sót sau đột biến : 0,12%.
- Sàng lọc sau đột biến: đã tuyển chọn ngẫu nhiên 32 biến chủng và thử khả năng STH kháng sinh, để chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao. Kết quả được trình bày ở bảng 8.
Bảng 8: Các biến chủng có % biến đổi hoạt tính (+) cao sau đột biến Biến chủng SL Shi D (mm) s % biến đổi hoạt tính D (mm) s %biến đổi hoạt tính 12.5 19,73 0,25 139,73 21,14 0,16 140,19 12.8 18,71 0,33 132,51 19,84 0,37 131,56 12.13 16,45 0,48 116,50 18,49 0,26 122,61 12.16 17,20 0,09 121,81 19,25 0,41 127,65 12.17 19,38 0,16 137,25 20,75 0,18 137,60 12.20 17,79 0,62 125,99 19,46 0,80 129,05 12.24 18,36 0,25 130,03 19,81 0,44 131,37 12.26 16,94 0,55 119,97 18,49 0,12 122,61 12.29 18,94 0,25 134,13 19,96 0,58 132,36 12.31 17,48 0,05 123,80 19,13 0,41 126,86 Chứng 14,12 0,36 100 15,08 0,25 100 Nhận xét:
- Như vậy sau đột biến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của biến chủng
1 2 tăng lên rõ rệt.
- Từ bảng kết quả trên quyết định giữ lại 3 biến chủng có % biến đổi hoạt tính dương cao nhất trên cả 2 vsv kiểm định: 5, 17, 29 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.6.Kết quả lên men sau đột biến.
Ba biến chủng giữ lại sau đột biến được tiến hành lên men chìm trên MT2. Kết quả được giới thiệu ở bảng 9 dưới đây:
Bảng 9: Kết quả lên men chìm biến chủng sau đột biến
Ký hiệu biến
chủng
Đường kính vòng vô khuẩn
SL Shi D (mm) s D (mm) s 5 19,23 0,08 22,45 0,15 17 17,84 0,43 19,27 0,11 29 18,11 0,77 20,15 0,27 Nhận xét:
- Qua kết quả trên ta thấy biến chủng 5 có hoạt tính kháng sinh cao nhất trên cả 2 vsv kiểm định khi nuôi cấy bề mặt cũng như lên men chìm,
- So sánh với kết quả ở bảng 7 ta thấy hoạt tính kháng sinh sau khi lên men chìm của 3 biến chủng sau đột biến tăng so với 3 biến chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên, chứng tỏ cải tạo giống có kết quả tốt.
«í» Đã khảo sát độ bền vững của kháng sinh trên các pH khác nhau. Kết quả xin giới thiệu ở bảng 10. Vi sinh vật kiểm định là Shigeỉlaýlexneri.
Bảng 10: Ảnh hưởng của pH đến độ bền vững của kháng sinh
pH
Đường kính vòn.g vô khuẩn (mm)
Sau ] ngày Sau 5 ngày
D (mm) s D (mm) s 3 18,32 0,25 18,08 0,37 5 19,89 0,09 19,23 0,12 7 19,43 0,42 19,04 0,09 9 11,37 0,21 10,15 0,45 11 10,98 0,57 14,56 0,67
Nhận xét:
- Kháng sinh do chủng Streptomyces 13.312 tổng hợp khá bền vững trong khoảng pH rộng.
- Kháng sinh bền vững nhất ở pH = 5. Giữ dịch lên men ở pH = 5 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.7. Kết quả lựa chọn dung môi chiết thích hợp của dịch lên men
Sử dụng các dung môi chiết khác nhau. Tiến hành chiết 1 lần tại pH = 3, 5, 7, 9, 11. Đánh giá hoạt tính kháng sinh ở pha dung môi hữu cơ (dmhc), pha dịch lọc (N). Kết quả trình bày ở bảng 11.
Bảng 11: Kết quả chiết một lần kháng sinh bằng dung mỏi hữu co ỏ các pH khác nhau (VSV kiểm định là Shigella fỉexnerì)
pH
Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Butylacetat Cloroíorm N dmhc N dmhc 3 0 , 0 0 18,63 0 , 0 0 17,87 5 0 , 0 0 2 0 , 0 2 0 , 0 0 19,46 7 0 , 0 0 19,49 0 , 0 0 18,53 9 0 , 0 0 15,87 0 , 0 0 15,21 11 0 , 0 0 15,72 0 , 0 0 14,98 Nhận xét:
- Cả Butylacetat và Cloroíorm đều chiết được hết kháng sinh từ dịch lọc ở cả 5 pH
2.2.7. Kết quả sắc ký lớp mỏng
Dịch chiết butylacetat ở pH = 5 được sử dụng để chấm sắc ký lớp mỏng. Sau khi sử dụng 25 hệ dung môi chọn được 5 hệ tách tốt, có thành phần như sau:
Hệ 1 : Dicloromethan : dimethylíormamit : 10:5 Hệ 2 : Butylacetat: methanol: aceton : 1 6 : 4 : 2 Hệ 3 : Cloroform: ethanol: amoniac 25% : 8 : 2 : 0,05 Hệ 4 : Ethylacetat: Ethanol: acid acetic : 5 : 3 : 0,5 Hệ 5 : Diclomethan : propanol : 2 : 3 Bảngỉ2: Kết quả sắc ký lớp mỏng Hệ dung môi Rf uv v sv Thuốc thử hoá học Hệ 1 - 0,83 - Hệ 2 - 0,77 - Hệ 3 - 0,60 - Hệ 4 - 0,85 - Hệ 5 - 0,69 - Nhận xét:
- Kết quả sắc ký cho thấy dịch chiết có một vết kháng sinh hiện hình bằng phương pháp vsv.
- Vết kháng sinh này không phát quang dưới ánh sáng tử ngoại và cũng không cho phản ứng mầu với thuốc thử hoá học đã sử dụng.
Phần 3 KẾT LUẬN
1.Kết luận:
Sau thời gian tiến hành làm thực nghiệm chúng tôi đã hoàn thành được các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả sau:
- Phân loại theo ISP chúng tôi đã cơ bản xác định được Streptomyces 13.312
là Streptomyces griseosporeus.
- Streptomyces 13.312 là xạ khuẩn được phân lập từ cơ chất Việt Nam trong quá trình nuôi cấy tạo ra một kháng sinh phổ rộng, có tác dụng tốt trên cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-).
- Khi nuôi cấy trên bề mặt Streptomyces 13.312 STH kháng sinh tốt nhất trên MT3- là môi trường phân lập. Tuy nhiên khi lên men chìm MT2dd là môi trường tốt nhất.
- Qua quá trình cải tạo và chọn giống v s v đã thu được 3 biến chủng có khả năng STH kháng sinh tốt hơn chủng gốc đó là các biến chủng 5, 17, 29.
- Kháng sinh do chủng Streptomyces 13.312 tạo ra khá bền vững trong khoảng pH rộng, bền nhất tại pH5.
- Kháng sinh chiết được dễ dàng bằng butylacetat và cloroíbrm.
- Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy có một vết có hoạt tính kháng sinh.
2.Đề xuất:
Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi có một số đề xuất sau:
- Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về chủng Streptomyces 13.312 đặc biệt là quá trình chiết xuất và tinh chế.
- Tiến hành cải tạo giống để thu được chủng có khả năng STH kháng sinh ngày càng tốt hơn.
-Lên men trên quy mô lớn sau đó chiết xuất và tinh chế nhằm thu được một lượng kháng sinh đủ để tiến hành xác định cấu trúc, tính chất lý hoá và tiến hành thử tiền lâm sàng đối với chất kháng sinh này nếu điều kiện cho phép.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1], Bộ môn Hoá dược(1998) - Hoá dược II- Trường ĐH Dược Hà Nội
[2], Bộ môn Hoá phân tích(1999)-Hoá phân tích II- Trường ĐH Dược Hà Nội [3], Bộ môn Hoá sinh- Vi sinh (1999)-Vi sinh học-Trường ĐH Dược Hà Nội
[4]. Nguyên Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997)- Vi sinh vật học-Nhà xuất bản giáo dục
[5], Từ Minh Koóng chủ biên (2001)- Kỹ thuật sản xuất Dược phẩm- Tập 1-
Truờng ĐH Dược Hà nội
[6], Lê Đình Lương- Phan Cự Nhân (2000)- Cơ sở di truyền học- NXB Giáo dục
[7], Nguyễn Tiên Phong (2000)- “Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Mỉcromonospora N°9 Khoá luận tốt nghiệp DSĐH, Hà Nội.
[8], HỒ Viết Quí(2001)-C/ỉ/ếí tách, phân chia, xác định các chất bằng dung môi hữu cơ, -NXB Khoa học và kỹ thuật. Tập 1.
[9], Cao Văn Thu(1998)- Bài giảng kháng sinh và vitamin- Hà Nội.
[10]. Cao Văn Thu, Nguyễn Thị Hoa (1999)- “Qui hoạch đơn hình nghiên cứu lên men STH kháng sinh” -Tạp chí Dược học, Số 1, trang 12-14.
[11], Huỳnh Thu Trang(2002)- “ Góp phần nghiên cứu kháng sinh từ chủng Streptomyces 315”- Khoá luận tốt nghiệp DSĐH, Hà Nội
[12]. Indrani Datta, Mita Banerjee, Shanka Kumar Mukherjee and Saroj Kanti Majumdar(2 0 0 1), “JU-2, a novel phosphorous-containing antifungal antibiotic from Streptomyces kanamyceticus Mg”, Indian Journal of Experimental Biology, Vol.39, P.604-606.
[13]. Jun Kohno, Takuya Kawahata, Toru Otake, Motoko Morimoto, Haruyo Mori, Noboru Ueba, Maki Nishio, Akio Kinumaki, Saburo Komaisubara and
Keisuke Kawashima (1996), “Boromycin, an Anti-HIV Antibiotic”, Biosci, Biotech, Biochem, Vol.60, No.3, P. 1036-1037.
[14]. Shigetoshi Okada, Sinroku Iwamatu (1997) - “Scale-up Production of Milbemycin by Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus with Control of Internal pressure, Temperature, Aeration and Agitation”, J, Chem, Technol, Biotechnol, Vol.70, P.179-187.
[15]. E.B Shilling and D.Gottleib (1966), “Methods for characterization of Streptomyces species”, Int.J.Syst. Bacteriol., Vol.16, No.3, P.313-340.
[16]. Selman A. Waksman (1957), The Actinomyces, London Bailliere. Tidall and Cox, LTD, Vol.II, page 82-87 and 92-93.
Hình 3: Kết quả thử hoạt tính của dịch lọc sau lên men bằng phương pháp giếng thạch.