2.2.1.1. Hạt vừa gói xong
* Để khảo sát khả năng cố định tế bào của alginat ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi tiến hành tạo hạt với alginat ở ba nồng độ 2,0%, 2,5% và 3,0%. Sau mỗi lần tạo hạt, tiến hành đếm số lượng tế bào gói được trong lg hạt calci alginat chúng tôi thu được kết quả sau:
Chú thích: (-): Đĩa không có khuẩn lạc mọc hoặc không tiến hành thí nghiệm (+): Đĩa có quá nhiều khuẩn lạc không đếm được
Bảng 1: Số lượng tế bào gối được trong 1 gam hạt calci alginat 2,0%
Lần TN Số lượng tế bào x i o 9 x io 8 x i o 7 X l ơ6 1 - 4 30,67 253 2 - 8,67 27,33 214,8 3 - 7,33 46 Ổ ỵ Trung bình - 6,67 34,67 233,9 Nhận xét:
- Kết quả bảng 1 cho thấy số lượng tế bào gói được trong lg hạt alginat 2,0% vào khoảng 2,34 - 6,67 X 108 tế bào.
Bảng 2: Số lượng tế bào gói được trong 1 gam hạt calcỉ alginat 2,5% Lần TN Số lượng tế bào x i o 9 x i o 8 x i o 7 x i o 6 1 2 2 31 + 2 4 9,33 73,33 + 3 - 8 41,33 286,67 4 - 9 41,33 296 5 2 10,67 25,33 306 6 - 14 36 266 Trung bình 2,67 8,83 41,39 288,67 Nhận xét:
- Kết quả bảng 2 cho thấy số lượng tế bào gói được trong lg hạt alginat 2,5% vào khoảng 2,89 X 108- 2,67 X 109 tế bào.
Bảng 3: Số lượng tế bào gói được trong 1 gam hạt calci alginat 3,0%
Lần TN Số lượng tế bào x i o 9 x i o 8 x i o 7 x i o 6 1 4 24 45,33 261,33 2 - 8 33,33 296 3 - 14 77,33 370,67 Trung bình 4 15,33 52 309,33 Nhận xét:
- Kết quả bảng 3 cho thấy số lượng tế bào gói được trong lg hạt alginat 3,0% vào khoảng 3,09 X 108 - 4 X 109 tế bào.
* Sau khi có kết quả, chúng tôi tiến hành so sánh số lượng tế bào trung bình gói được trong lg hạt gel calci alginat ở các nồng độ trên. Kết quả thu được trong bảng 4:
Bảng 4: So sánh số lượng tế bào gói được trong ỉg hạt ở các nồng độ alginat khác nhau
Nồng độ alginat 2,0% 2,5% 3,0%
Số lượng tế bào
Nhận xét:
- Số lượng tế bào gói được trong lg hạt đều nằm trong khoảng 108 - 109 tế bào. - So sánh số lượng tế bào gói được trong trong lg hạt ở ba nồng độ 2,0%, 2,5% và 3,0% cho thấy không có sự khác biệt nhiều về số lượng tế bào gói được ở các nồng độ alginat khác nhau.
* Để khảo sát mối liên hệ giữa số lượng tế bào có trong dịch tế bào dùng để tạo hạt và số lượng tế bào gói được trong hạt, chúng tôi tiến hành cố định tế bào với 1, 2 và 3 bình giống. Số lượng tế bào trung bình có trong 1 bình giống vào khoảng 108 - 109 tế bào/lOOml dịch nuôi cấy. Kết quả thu được trong bảng 5:
Bảng 5: So sánh số lượng tế bào trung bình gói được trong 1 gam hạt khi tăng mật độ tế bào
Số bình giống sử dụng 1 2 3
Sô lượng tế bào 0,08
8,37 18,89 5 6.75 4.76 8,48 ( x ĩo 8) 0,67 5,36 2 9,07 17,79 Trung bình (x 108) 0,92 ±0,46 10,75 ± 2,28 6,66 ±0,88 Nhận xét:
- Khi chỉ dùng 1 bình giống để cung cấp tế bào cho quá trình bất động, lượng tế bào gói được trong lg hạt tương đối thấp (< 108).
- Khi sử dụng 2 bình giống để tạo hạt, số lượng tế bào gói được vào khoảng 10,8 X 108 tế bào/ lg hạt.
- Khi sử dụng 3 bình giống để tạo hạt, số lượng tế bào gói được vào khoảng 6,66 X 108 tế bào/ lg hạt.
- Không có sự khác nhau nhiều về số lượng tế bào gói được trong lg hạt giữa việc sử dụng 2 bình giống hay 3 bình giống để tạo hạt.
2.2.1.2. Hạt sau 24h lên men liên tục
Để đánh giá khả năng sinh sản của tế bào nấm men ở trạng thái bất động và khả năng cố định tế bào của alginat trong quá trình lên men liên tục, chúng tôi tiến hành lến men liên tục trong 24h. Sau 24h, lấy lg hạt trong cột rửa sạch bằng nước cất vô trùng rồi đếm số lượng tế bào. Kết quả thu được thể hiện trong bảng dưới đây:
Bảng 6: Số lượng tế bào có trong 1 gam hạt sau 24h lên men liên tục với alginat 2,5% L ầnT N Số lượng tế bào x i o 9 x i o 8 x i o 7 1 11,33 98,67 932,67 2 8,67 95,33 576,66 3 12 101,33 480 4 - 209,33 342,67 5 6,67 68 353,33 Trung bình 9,67 114,53 537,07 Trung bình có (8,83 ± 1,47) X 109tế bào / lg hạt
Bảng 7: Số lượng tế bào có trong 1 gam hạt sau 24h lên men liên tục với alginat 3% Lần TN Số lượng tế bào x i o 9 x i o 8 x i o 7 1 12,67 150,67 829,33 2 - 12 114 3 - 16 144 Trung bình 12,67 59,56 362,44 Trung bình có (7,42 ± 2,21) X 109tế bào / lg hạt Nhận xét:
- Vói alginat 2,5%, số lượng tế bào còn lại trong hạt vào khoảng 8,83 X 109tế bào/lg hạt - Với alginat 3,0%, số lượng tế bào còn lại trong hạt vào khoảng 7,42 X 109tế bào/lg hạt
- Sau 24h lên men liên tục, lượng tế bào còn lại trong hạt khá lớn (khoảng 109 - 1010 tế bào/lg hạt)
- So sánh hai nồng độ alginat 2,5% và 3% cho thấy số lượng tế bào còn lại trong hạt sau 24h lên men liên tục không có sự khác biệt rõ rệt.
2.2.1.3. Hạt sau 24h lên men tĩnh
Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng cố định tế bào của alginat ở trạng thái lên men tĩnh ở hai nồng độ alginat 2,5% và 3%. Sau 24h lên men tĩnh, lấy lg hạt rửa sạch bằng nước cất vô trùng rồi tiến hành xác định số lượng tế bào .
Bảng 8: Số lượng tếbào có trong 1 gam hạt sau 24h lên men tĩnh với alginat 2,5%
Lần TN Sô lượng tế bào
x i o9 x l ữ 8 x i o 7 1 6,67 56,67 447,33 2 14,67 21,33 72 3 - 13,33 52 4 10,67 21,33 93,33 5 4 24 234,67 Trung bình 9 27,33 179,87 Trung bình có (4,51 ± 1,85) X 109tế bào / lg hạt
Bảng 9: Số lượng tế bào có trong 1 gam hạt sau 24h lên men tĩnh với alginat 3%
LầnTN Số lượng tế bào x i o 9 x i o 8 x i o 7 1 7,33 37,33 154 2 - 8,67 64 3 1,33 8 30 Trung bình 4,33 18 82,67 Trung bình có (2,32 ± 0,85) X 109tế bào / lg hạt Nhận xét:
- Số lượng tế bào có trong gel alginat 2,5% là khoảng 4,51 X 109 tế bào / lg hạt - Số lượng tế bào có trong gel alginat 3,0% là khoảng 2,32 X 109tế bào / lg hạt
- Sau 24h lên men tĩnh, lượng tế bào còn lại trong hạt khá lớn
- Không có sự khác biệt nhiều về số lượng tế bào còn lại trong hạt sau 24h lên men tĩnh giữa alginat 2,5% và 3,0%.
2.2.1.4. So sánh số lượng tế bào có trong Ig hạt trước khi lên men, sau 24h lên men liên tục và sau 24h lên men tĩnh
Kết quả thu được trong bảng 10:
Bảng 10: So sánh số lượng tế bào trung bình có trong 1 gam hạt trước khi lên men, sau 24h lên men liên tục và sau 24h lên men tĩnh
LầnTN
Hạt trước khi lên men
( x io 8)
Hạt sau 24h lên men liên tục (x 108) Hạt sau 24h lên men tĩnh (XI08) 1 8,4 101,8 56 2 18,9 79,9 58,4 3 5 89,8 - 4 5,4 121,8 9,3 5 9,1 - 45,8 6 - 56,7 29,2 7 6,8 - - 8 17,8 120,1 42 9 1,4 11,7 7,6 10 8,5 15,2 8,1 Trung bình 9 ±1,8 74,6 ± 14,3 32,1 ±7,13 Nhận xét:
- Số lượng tế bào trung bình có trong lg hạt trước khi lên men vào khoảng 9 X108 tế bào - Số lượng tế bào trung bình có trong lg hạt sau 24h lên men liên tục là khoảng 74,6 X 108 tế bào
- Số lượng tế bào trung bình có trong lg hạt sau 24h lên men tĩhh là khoảng 32,1 X
108 tế bào
- Số lượng tế bào trong hạt sau khi lên men không giảm so với hạt trước khi lên • men, thậm chí còn cao hơn.
- Số lượng tế bào trung bình có trong lg hạt sau 24h lên men liên tục và sau 24h lên men tĩnh không có sự khác biệt rõ rệt.
2.2.2. Số lượng tế bào có trong dịch lên men
2.2.2.1. Số lượng tế bào có trong lml dịch lên men liên tục ở các thời điểm khác nhau
Đánh giá quá trình bị rửa trôi của tế bào ở trạng thái bất động khi lên men liên tục được tiến hành bằng cách đếm số lượng tế bào trong dịch lên men ở các thòi 9 điểm khác nhau, kết quả thể hiện trong bảng 11:
Bảng 11: Số lượng tế bào có trong lm l dịch lên men sau lh, 6h, 8 -lOh và sau 24h lên men liên tục
Thòi gian lh 6h 8h - lOh 24h
130 Số lượng tế 7 60 0 45 4 bào 3,2 70 47 7,3 ( x i o 4) 3,4 120 4,3 87 Trung bình 4,53 ± 1,01 93,4 ± 12,25 46 ±0,71 5,4 ±0,67 Nhận xét:
- Trong dịch lên men luôn có tế bào nấm men vói lượng từ 104 - 105 tế bào/ml - Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men ở thời điểm 6h là cao nhất - Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men ở thời điểm lh và 24h ít hơn ở thời điểm 6h và 8 - lOh.
Thời gian (h)
222.2. Số lượng tếbào có trong lml dịch lên men sau 24h lên men tĩnh
Để khảo sát khả năng rửa trôi của tế bào bất động ở trạng thái lên men tĩnh chúng tôi xác định số lượng tế bào có trong lml dịch lên men sau 24h lên men tĩnh. Kết quả thu được trong bảng 12:
Bảng 12: Số lượng tế bào trung bình có trong lml dịch lên men sau 24h lên men tĩnh
Lần TN Sô lượng tế bào (x l ơ 4)
1 6,66
2 4
3 21
Trung bình 10,55 ±4,31
Nhận xét:
- Trong dịch lên men tĩnh có tế bào nấm men vói lượng 104- 1 0 5 tế bào/ml.
2.223. Số lượng tế bào có trong lml dịch lên men sau 24h lên men tĩnh bất động tế bào bằng thạch Agar
Để khảo sát khả năng bất động tế bào của một số cơ chất khác, chúng tôi thử bất động tế bào bằng thạch rồi nuôi cấy tĩnh trong 24h. Tiến hành xác định số lượng tế bào có trong lml dịch lên men tĩnh sau 24h này ta được kết quả trong bảng 13:
Bảng 13: Số lượng tếbào có trong lml dịch sau 24h lên men tĩnh bằng tế bào được bất động trong thạch Agar
Lần TN Số lượng tế bào x i o 6 x l O s x i o 4 1 2 15,33 - 2 4 13 130 3 - 4 23,34 Trung bình 3 10,78 76,67 Trung bình có (1,62 ± 0,57) X 106 tế bào/ lml dịch. Nhận xét:
- Trong dịch lên men có lượng tế bào khoảng 106 tế bào/ lml dịch
- Lượng tế bào có trong lml dịch lên men tĩnh trong trường hợp bất động tế bào bằng thạch nhiều hon so vói khi bất động tế bào bằng alginat.
2.3. BÀN LUẬN
Khi bất động tế bào bằng alginat của Đại học Thủy sản Nha Trang chúng tôi nhận thấy gel nhanh chóng được tạo thành, hạt gel đều và chắc. Như vậy, có thể thấy nguồn alginat này tạo gel khá tốt. Điều này cũng đã được nêu ra trong nghiên cứu của tác giả Ngô Đăng Nghĩa. Đây là một yêu cầu quan trọng khi alginat được sử dụng làm chất mang để cố định tế bào. [7]
Nghiên cứu khả năng cố định tế bào nấm men s. cerevisiae ở các nồng độ alginat 2,0%, 2,5%, 3,0% chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào gói được trong lg hạt gel ở mỗi nồng độ đều vào khoảng 108 -109 tế bào. Kết quả này cho thấy: trong khoảng nồng độ 2 - 3%, khi thay đổi nồng độ alginat ít làm ảnh hưởng đến số lượng tế bào cố định được trong hạt. Sự thay đổi nồng độ này chủ yếu ảnh hưởng đến khả năng tạo gel của alginat. Chúng tôi không tiến hành nghiên cứu ở các nồng độ alginat nhỏ hơn vì theo kết quả nghiên cứu của Lê Huy Tường, ở nồng độ alginat < 1,5% sự tạo gel không xảy ra, ở nồng độ 1,5% hạt bất đầu được tạo thành nhưng hạt mềm và chỉ có một lớp mỏng bên ngoài tạo gel. Còn ở nồng độ cao, dung dịch alginat quá đặc và sự tạo gel cũng rất khó khăn. [11]
Nghiên cứu khả năng cố định tế bào của alginat khi thay đổi mật độ tế bào đưa vào dung dịch tạo hạt, kết quả của bảng 5 cho thấy: khi chỉ sử dụng 1 bình giống thì số lượng tế bào gói được trong hạt tương đối thấp. Khi sử dụng 2 và 3 bình giống, số ,)
( lượng tế bào gói được trong hat tăng lên. Số lượng tế bào gói được trong hạt khi sử đụng 2 hay 3 bình giống không khác nhau nhiều. Như vậy, có thể thấy gel alginat có khả năng cố định được một lượng tế bào nhất định vào khoảng 108 - 109 tế bào/ lg hạt. Tăng lượng tế bào đưa vào không làm tăng số lượng tế bào gói được trong hạt, lượng tế bào thừa không được cố định sẽ bị loại đi khi ta rửa hạt. Kết quả cũng cho thấy lượng tế bào trong 2 bình giống cung cấp đủ tế bào cho việc tạo hạt.
Lượng tế bào được cố định trong hạt khá lớn (108 - 109 tế bào/ lg hạt). Điều này đã tạo mật độ tế bào cao trong cột lên men cho phép lên men vói tốc độ rất nhanh. Sau khi cơ chất chảy qua cột ta đã thu được cồn thoát ra ở đầu dưới cột. Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Đăng Nghĩa thì ở thời điểm sau 8 - 9h lên men, nồng độ cồn thu được là > 4%.
Lượng tế bào có trong 1 gam hạt sau 24h lên men liên tục và lên men tĩnh không giảm so với hạt trước khi lên men. Điều này chứng tỏ gel alginat cố định tế bào khá tốt. Thêm vào đó, trong dịch lên men luôn có tế bào nấm men chứng tỏ rằng tế bào vẫn tiếp tục sinh sản trong quá trình lên men bất động. Như vậy, có thể thấy khả năng bù đắp của các tế bào bất động trong quá trình lên men là rất lớn. Đây là một yêu cầu quan trọng để có thể lên men liên tục trong một thời gian dài. Các nhà khoa học cũng đã nghiên cứu về quá trình bất động các tế bào ở trạng thái đang phát triển và nhận thấy rằng: bất động các tế bào ở trạng thái đang phát triển bằng cách cung cấp các chất dinh dưỡng cho chúng để duy trì các chức năng sinh học của chúng rất có lợi bỏi vì các tế bào ở pha phát triển này sẽ sinh ra các tế bào mới làm tăng thêm và tái tạo lại các chất xúc tác sinh học có hoạt tính và duy trì chúng trong suốt thời gian sử dụng. Tuy nhiên, khi bất động tế bào ở pha phát triển cũng gặp phải những nhược điểm nhất định. Những nhược điểm đó là:
- Các chất dinh dưỡng và các nguồn năng lượng bị tiêu thụ bởi các tế bào bất động đang ở pha tăng trưởng để duy trì sự phát triển của chúng. Điều này có thể làm giảm hiệu suất của quá trình do các tế bào bất động đã tiêu thụ cơ chất và/ hoặc sản phẩm như thể chất dinh dưỡng và năng lượng của chúng.
- Sản phẩm có thể còn lẫn nhiều tế bào do các tế bào thoát khỏi các chất mang. [13] Kết quả nghiên cứu ở bảng 11 cho thấy trong dịch lên men liên tục ở các thời điểm khác nhau luôn có tế bào. Ở thòi điểm lh và 24h, số lượng tế bào vào khoảng
104 tế bào/ lml dịch, còn ở thời điểm 6h và 8 - lOh, số lượng tế bào khoảng 106 - 107 tế bào/ lml dịch. Số lượng tế bào này phù hợp vói trạng thái phát triển của tế bào nấm men trong cột lên men. Trong khi đó, lượng tế bào trong hạt gel vẫn luôn ổn định nên có thể thấy rằng phần lớn các tế bào thoát ra này là các tế bào được sinh ra thêm trong quá trình lên men. Sau 6h lên men liên tục, tế bào ở trạng thái phát triển mạnh nhất thể hiện ở lượng C 02 sinh ra rất nhiều, trạng thái này kéo dài khoảng 10 h rồi yếu dần đi. Lượng tế bào có trong dịch lên men cũng tuân theo qui luật này. Như vậy, do alginat chỉ cố định được một lượng tế bào nhất định nên khi tế bào sinh sản