3.2.12.1 Cố định mẫu bằng Canada balsam Chuẩn bị
- Lamelle.
- Dùng keo Canada balsam. - Kim mũi giáo.
- Giấy thấm.
- Pha loãng keo với xylen để dán, tỉ lệ keo và xylen tùy vào độ đặc của keo Canada balsam.
Tiến hành
-Nhỏ giọt keo lên lame sạch.
- Dùng hai tay nghiêng nhẹ nhàng lamelle xuống lame để tránh bọt khí, giọt keo dán nằm ngay vị trí giữa lamelle.
- Ấn nhẹ cho keo lan ra đều. Dùng vải sạch thấm xylen chùi hết keo lan ra ngoài lamelle (nếu có).
3.2.12.2 Dán nhãn
-Tên tổ chức: lưỡi, khí quản, phổi, thận, bàng quang, tinh hoàn. -Loài: thỏ, chuột, heo.
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN
Qua quá trình thực hiện tiêu bản mô trên thỏ, chuột, heo, tôi đã đúc 180 mẫu trong đó có 48 khối hoàn chỉnh. Cắt nhuộm được 354 tiêu bản và chọn ra 303 tiêu bản đạt yêu cầu những tiêu bản đạt yêu cầu gồm có: lưỡi thỏ (36 tiêu bản), gai lá heo (22 tiêu bản), khí quản chuột (31 tiêu bản), phổi chuột (34 tiêu bản), phổi thỏ (25 tiêu bản), phế quản lớn thỏ (25 tiêu bản), thận thỏ (36 tiêu bản), bàng quang thỏ (54 tiêu bản), dịch hoàn chuột (40 tiêu bản).
Tôi đã khảo sát phương pháp thực hiện tiêu bản hiển vi cố định mô động vật và tìm ra thứ tự thời gian cố định mẫu thích hợp cho từng loại tổ chức như sau: cố định 24 giờ là lưỡi, khí quản, phổi, thận, dịch hoàn, cố định 36 giờ là bàng quang.
Các tiêu bản hoàn chỉnh phải đạt yêu cầu sau: Tiêu bản trong, sạch, lát cắt có độ dày thích hợp.
Tiêu bản có màu tương phản, phân biệt rõ cấu trúc tế bào: nhân có màu tính xanh (màu Hematoxylin), tế bào chất có màu hồng nhạt (màu Eosin Y).
Trong quá trình thực hiện tiêu bản với:
Qui trình thực hiện tiêu bản đơn giản dễ tiến hành. Mẫu bắt màu tốt, có sự tương phản rõ rệt:
Nhân màu tím.
Tế bào chất màu hồng.
Các lớp tổ chức có thể phân biệt được dưới kính hiển vi quang học.
Tuy nhiên do thiếu kinh nghiệm, kỹ năng và trang thiết bị đa phần bị hỏng nên gặp nhiều khó khăn và trở ngại.
KẾU QUẢ MÔ HỌC 4.1 Lưỡi
Thưc hiện 97 tiêu bản, trong đó có 75 tiêu bản trên thỏ có 36 tiêu bản hoàn chỉnh, quan sát được 25 tiêu bản gai chỉ, 6 tiêu bản gai nấm, 5 tiêu bản gai đài, 22 tiêu bản trên heo có 22 tiêu bản hoàn chỉnh, có 22 tiêu bản quan sát được gai lá. Khi thực hiện tiêu bản lưỡi cần xác định vị trí gai lưỡi theo từng loại khi lấy mẫu lớn và khi đúc cần đặt lưỡi sao cho mặt cắt vuông gốc với góc lưỡi.
Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi quang học ta thấy bề mặt lưỡi là lớp gai có 4 loại: gai chỉ, gai nấm, gai đài, gai lá. Bên dưới gai lưỡi là một khối cơ vân có lẫn thần kinh và mạch máu.
4.1.1 Gai chỉ 4.1.2 Gai nấm Gai nấm Hình 4.2 Gai nấm thỏ (vật kính 10X) Tổ chức liên kết Hình 4.1 Gai chỉ thỏ (vật kính 10X) Gai chỉ Cơ vân Tổ chức liên kết
4.1.3 Gai đài 4.1.4 Gai lá Hình 4.3 Gai đài thỏ (vật kính 10X) Cơ vân Gai đài Tổ chức liên kết Hình 4.4 Gai lá heo (vật kính 10X) Gai lá
4.2 Khí quản
Thực hiện được 31 tiêu bản khí quản chuột hoàn chỉnh. Quan sát dưới kính hiển vi quang học ta thấy được:
Lớp niêm mạc:
Lớp biểu mô: là biểu mô phủ kép trụ giả. Lớp đệm: là mô liên kết thưa.
Lớp dưới niêm mạc: có vòng sụn chữ C. Lớp thanh mạc: là một màng liên kết thưa.
Nụ vị giác
Hình 4.5 Gai lá heo (vật kính 40X)
Tổ chức liên kết
4.3 Phổi
Thực hiện 84 tiêu bản hoàn chỉnh, 50 tiêu bản trên thỏ, có 25 tiêu bản thấy được phế quản lớn, 34 tiêu bản trên chuột, có 34 tiêu bản thấy được phế quản lớn. Quan sát phế quản lớn dưới kính hiển vi quang học ta thấy được:
Lớp niêm mạc: lớp biểu mô phủ kép trụ giả có lông rung. Lớp đệm: mô liên kết thưa. Dưới lớp đệm có Reissessen.
Lớp dưới niêm mạc : Có những mảnh sụn trong không đồng đều, phân bố xung quanh đường kính phế quản.
Quan sát phổi dưới kính hiển vi ta thấy được: Tiểu phế quản hô hấp
Ống phế nang
Túi phế nang và phế nang
. Hình 4.6 Khí quản chuột (Vật kính 40X) Cơ trơn Lớp biểu mô phủ kép trụ giả Sụn Tổ chức liên kết
4.3.1 Phế quản Hình 4.7 Phế quản lớn thỏ (vật kính 10X) Lớp biểu mô phủ kép trụ giả Cơ trơn Sụn Tổ chức liên kết Hình 4.8 Phế quản lớn thỏ (vật kính 40X) Lớp biểu mô phủ kép trụ giả Cơ trơn Sụn
Hình 4.9 Phổi thỏ (vật kính 10X) Động mạch Phế quản nhỏ Tĩnh mạch Hình 4.10 Phổi thỏ (vật kính 40X) Phế quản nhỏ Động mạch Phế nang Lớp biểu mô phủ kép trụ giả
4.4 Thận
Thực hiện 36 tiêu bản thận thỏ hoàn chỉnh, quan sát dưới kính hiển vi quang học ta thấy được:
Miền vỏ: tháp Ferrein, tiểu cầu thận, ống sinh niệu. Miền tủy: ống sinh niệu.
Hình 4.12 Miền vỏ thận thỏ (vật kính 40X) Tiểu cầu thận Tĩnh mạch Ống lượn xa Ống lượn gần Hình 4.11 Miền vỏ thận thỏ (vật kính 10X) Tĩnh mạch Tiểu cầu thận
4.5 Bàng quang
Thực hiện được 34 tiêu bản bàng quang thỏ hoàn chỉnh, quan sát dưới kính hiển vi quang học ta thấy được:
Lớp niêm mạc: có nhiều nếp gấp, cấu tạo biểu mô phủ kép biến dị. Lớp đệm: có nhiều sợi keo, ít sợi chun.
Hạ niêm mạc: là tổ chức liên kết thưa.
Lớp cơ: gồm 3 lớp cơ trơn, cơ dọc trong, cơ vòng giữa và cơ dọc ngoài. Hình 4.13 Miền tủy thận thỏ (vật kính 40X)
4.6 Tinh hoàn
Thực hiện được 40 tiêu bản dịch hoàn trên chuột hoàn chỉnh, quan sát dưới kính hiển vi quang học thấy đươc:
Ống sinh tinh: thành ống dẫn tinh, tinh nguyên bào, tiền tinh trùng, tinh trùng, tổ chức kẽ, màng trắng.
Ống dẫn tinh: thành ống dẫn tinh, tinh trùng. Hình 4.14 Bàng quang thỏ (vật kính 10X) Cơ dọc ngoài Biểu mô phủ kép biến dị Tổ chức liên kết Cơ vòng giữa Cơ dọc trong
Tổ chức kẽ Hình 4.15 Dịch hoàn chuột (vật kính 10X) Ống sinh tinh Tĩnh mạch Màng trắng Hình 4.16 Dịch hoàn chuột (vật kính 40X) Tinh trùng Tổ chức liên kết
Tinh nguyên bào
Hình 4.18 Phụ dịch hoàn chuột (vật kính 40X) Tổ chức liên kết Tinh trùng Hình 4.17 Phụ dịch hoàn chuột (vật kính 10X) Ống dẫn tinh có nhiều tinh trùng Tổ chức liên kết
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận
Bằng phương pháp tiêu bản cắt lát và nhuộm kép bằng Hematoxylin và Eosin Y, các mục tiêu của đề tài “thực hiện tiêu bản vi thể gai lưỡi, khí quản, phổi, thận, bàng quang, dịch hoàn” đã được thực hiện hoàn chỉnh.
Tiêu bản làm ra đáp ứng được các yêu cầu quan sát cấu trúc mô học, có thể phục vụ tốt cho nhu cầu nghiên cứu, học tập và giảng dạy.
5.2 Đề nghị
Cần trang bị lại các thiết bị đã hỏng như: tủ ấm, tủ lạnh, máy điều hòa nhiệt độ… để công việc nghiên cứu, học tập được thuận lợi hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.Hồ Thị Hà, 2008. Mô học. Trường Đại học Y – Đại học Huế.
2. Nguyễn Hoàng Phương, 1994. Phương pháp thực hiện tiêu bản mô động vật. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ.
3. Nguyễn Xuân Hoạt, Phạm Đức Lộ, 1978. Tổ chức học – Phôi thai học. Nhà xuất bản Đại học và trung học chuyên nghiệp.
4. Phạm Phan Địch, 1998. Mô học. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. 5.Trương Cam Cống, 1973. Tổ chức học. Nhà xuất bản y học.
6.Mariano S.H.Di Fiore, 1974. Atlas of human histology. Lea & Febgen Philadelphia.
PHỤ CHƯƠNG Bảng 1: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Khối mẫu vỡ có nhiều hạt
Paraffin xấu, không tinh khiết
Thay và lọc kỹ praffin Mẫu bật ra khỏi block
khi cắt, trong mẫu có khí
Thao tác đúc khuôn chậm
Đúc lại mẫu thao tác nhanh hơn
Mẫu khó cắt hay vỡ ra từng mảnh
Paraffin cứng quá Thay paraffin khác mềm
hơn
Tổ chức bị co rúm lại Nhiệt độ tẩm paraffin
cao hơn 65oC
Loại bỏ mẫu đó Khó cắt, tổ chức bị tước
xơ
Paraffin chưa thấm hoàn toàn vào tổ chức, chưa loại hết cồn và xylen
Tẩm lại paraffin lâu hơn, hoặc loại bỏ mẫu
Bảng 2: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi cắt mẫu
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Các mảnh cắt có độ dài không bằng nhau
Điều chỉnh máy cắt với tốc dộ không thích hợp
Tăng hoặc giảm tốc độ máy cắt, điều chỉnh dày mỏng lại cho thích hợp Mảnh cắt bị cuộn không
xếp băng
Mặt trên, dưới của khuôn mẫu và lưỡi dao không song song
Điều chỉnh khuôn mẫu cho mặt cắt song song
Mảnh cắt bị rách, thủng Dao cắt bị lục, mẻ, dơ Lau sạch lưỡi dao hoặc
thay lưỡi dao mới
Mẫu bị nứt, vụn nát Mẫu còn nước, nhiệt độ
tẩm paraffin quá cao, tốc độ quay không phù hợp
Chú ý nồng độ và thời gian ngâm cồn và nhiệt độ tẩm paraffin
Mảnh cắt bị răng cưa và dính vào dao
Paraffin mềm, nhiệt độ phòng quá nóng
Cắt dày hơn, điều chỉnh nhiệt độ máy lạnh Mảnh cắt dính lại vào
khuôn mẫu
Dao dơ, độ nghiêng của dao chưa đủ
Thay dao mới, kiểm tra độ nghiêng của dao
Bảng 3: Trở ngại, nguyên nhân và cách khắc phục khi tải, hấp và nhuộm
Trở ngại Nguyên nhân Khắc phục
Mẫu bị gấp nếp Nước trong chậu tải
không đủ nóng
Tăng nhiệt độ trong chậu tải
Mẫu bị rách Nhiệt độ nước quá cao Giảm nhiệt độ chậu tải
Bị tuột mẫu trong lúc nhuộm
Mạnh tay trong lúc nhuộm
Thao tác nhuộm phải chậm, nhẹ nhàng
Công thức pha Formol trung tính 10%
Formalin (37 – 40%) 100 ml
Nước cất 900ml
Sodium phosphate monobasie 4g
Sodium phosphate dibasie 6,5g
Phẩm nhuộm Hematoxylin
Hematoxylin là một phẩm nhuộm tự nhiên được chiết xuất bàng ether từ lõi cây Hematoxylen campechianum mọc ở rừng nhiệt mới, Mehico. Bản thân Hematoxylin không có đặc tính nhuộm mà phải trải qua quá trình oxy hóa để biến thành Hematein mới nhuộm được . Sự oxy hóa Hematoxylin gây nên do để dung dịch nhuộm từ 6 đến 8 tuần dưới ánh sáng mặt trời hoặc nó có thể oxy hóa bằng tác nhân hóa học như Iodate, Formanganat… trong khâu nhuộm, sử dụng chất oxy hóa mereuride oxide để sự oxy hóa Hematoxylin thành Hematein xảy ra tức khắc. Sự oxy hóa liên tục của Hematein sẽ hình thành một hợp chất không màu làm cho phẩm nhuộm không dùng được lâu. Chính vì vậy mà một số người cho rằng sự oxy hóa chậm một cách tự nhiên tốt hơn sự oxy hóa bằng hóa học. Hematoxylin là một phẩm nhuộm gián tiếp nên cần dùng thêm chất gắn màu là Alumum dưới dạng Alum (phèn chua) mới có thể ăn màu vào tổ chức. Hematoxylin là một phẩm nhuộm baze mạnh. Do đó, nó sẽ cố định trên acid nucleic là acid của nhân tế bào nên Hematoxylin dùng để nhuộm nhân và sau khi nhuộm nhân sẽ có màu tím xanh (Nguyễn Hoàng Phương, 1994).
Có nhiều cách pha Hematoxylin, tùy cách nhuộm mà chọn cách pha thuốc. Ở đây xin trình bày cách pha chế thuốc nhuộm theo Harris:
Tinh thể Hematoxylin 5g
Cồn tuyệt đối 50ml
Phèn chua 100g
Nước cất 1000ml
Moreuride oxide 2.5g
Cách pha chế Hematoxylin theo Harris với các bước tiến hành sau:
Hòa tan Hematoxylin trong cồn và phèn chua trong nước cất đun sôi, mang ra khỏi bếp và trộn hai dung dịch này lại.
Đun sôi nhanh không quá một phút luôn khuấy đều, tắt lửa rồi cho Moreuride oxide vào từ từ, khuấy đều, đun nhỏ lửa cho đến khi dung dịch có màu tím đậm. Mang ra khỏi bếp cho vào nước lạnh để làm lạnh nhanh, khi dung dịch nguội lại thì lọc trước khi dùng.
Lưu ý: Hematoxylin biến chất (có cặn, nâu đỏ) sẽ kết tủa màu nâu đen bên ngoài tế bào khi nhuộm. Để kiểm tra dung dịch Hematoxylin có bị loãng và biến chất hay không bằng cách nhỏ vài giọt Hematoxylin vào nước ấm, nếu thấy giọt phẩm nhuộm có màu đỏ một lúc sau mới thấy chuyển sang màu tím xanh là phẩm nhuộm đã loãng và biến chất phải loại bỏ. Nếu phẩm nhuộm có màu tím xanh ngay thì sử dụng được (Nguyễn Hoàng Phương, 1994).
Phẩm nhuộm Eosin: được sử dụng nhuộm tế bào chất.
Cách pha như sau: Eosin dự trữ:
Eosin 1g
Nước cất 20ml
Hòa tan và thêm cồn 95% 80ml
Eosin nhuộm:
Eosin dự trữ 1 phần
Cồn 800 2 phần
Hòa tan vào nhau và cho thêm 0.5ml acid acetic đậm đặc cho 100ml dung dịch trước khi dùng.