đường kớnh lớn, 4 – 5mm, bề mặt trơn búng ở giữa lồi lờn, dày và đậm màu sắc hơn cỏc vựng xung quanh + 5 ngày Màng mỏng, dễ vỡ B5 + 5 ngày Màng mỏng, dễ vỡ B6 B7 + 7 ngày Màng mỏng, nhăn nheo bỏm theo thành bỡnh mỏng, dễ vỡ, dịch nuụi cấy đục B8 B9 + 5 ngày Mỏng, dễ vỡ, dịch nuụi cấy đục B10 + 5 ngày Màng dày,dễ vỡ B11 - B12 - B13 + 5 ngày Màng mỏng, dễ vỡ B14 + 7 ngày Màng mỏng.dễ vỡ, dịch nuụi cấy đục B15 -
B16 + 6 ngày Màng dày, dai
B17 - B18 - B19 - B20 + 6 ngày Màng mỏng,nhăn nheo,bỏm theo thành bỡnh mỏng, dễ vỡ dịch nuụi cấy đục
B21 + 5 ngày Màng rất dày, khỏ dai
X1 Khuẩn lạc Khuẩn lạc đường kớnh 1,5 – 2mm vàng nõu
X2 + 6 ngày Màng rất dày, khỏ dai
X3
X4
X5 + 6 ngày Màng dầy vừa phải, nhẵn
khỏ dai
X6 + 7 ngày Màng khỏ dầy, khụng dai
X7
X8 -
X9 + 6 ngày Màng mỏng, dễ vỡ
X10 + 7 ngày Màng mỏng, dai, dịch nuụi
cấy trong
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
X12 + 5 ngày Màng mỏng,dai
X13 -
X14 -
X15 -
X16 + 5 ngày Màng dày, dai
X17 + 7 ngày Màng dày, dễ vỡ
X18 -
X19 -
X20 -
X21 + 6 ngày Màng mỏng,dai, dịch nuụi
cấy trong
X22 -
X23 + 6 ngày Màng dày, dai
X24 + 7 ngày Màng mỏng,dai, dịch nuụi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
cấy trong X25 - N1 Khuẩn lạc nhỏ 0,8 – 1mm; bề mặt trơn búng, màu trắng sữa + 4 ngày Màng rất dai, nhẵn, mỏng N2 + 5 ngày Màng khỏ dai, mỏng N3 + 3 ngày Màng khỏ dai, mỏng N4 + 5 ngày Màng mỏng, khụng nhẵn N5 + 6 ngày Màng mỏng, dai N6 + 5 ngày Màng khỏ dầy nhẵn
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
Qua kết quả được dẫn ra ở bảng trờn ta thấy cú 27 mẫu cú khả năng tạo màng trờn tổng số 52 mẫu vi khuẩn, 27 mẫu vi khuẩn này cho màng với đặc điểm khỏc nhau chia thành cỏc loại sau:
+ Loại thứ nhất: mẫu vi khuẩn cho màng dai, dịch nuụi cấy trong. + Loại thứ hai: cỏc mẫu vi khuẩn cho màng dai, dịch nuụi cấy đục + Loại thứ ba: cỏc mẫu vi khuẩn cho màng tan, dịch nuụi cấy trong. + Loại thứ tư: cỏc mẫu vi khuẩn cho màng tan, dịch nuụi cấy đục. Chỳng tụi giữ lại cỏc chủng vi khuẩn cho màng dai, mỏng để tiếp tục tiến hành cỏc thớ nghiệm. Tuy nhiờn, nhận thấy cỏc mẫu thuộc nhúm 3 đặc điểm khuẩn lạc khỏ đồng nhất, trong 6 chủng thỡ cú 5 chủng cú khả năng cho màng dai, mỏng theo mục đớch nghiờn cứu cần chọn cỏc chủng tạo màng mỏng, do vậy chỳng tụi lựa chọn cỏc chủng vi khuẩn thuộc nhúm 3 để tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
3.2.2. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum tạo màng mỏng (tuyển chọn lần 2)
Cơ sở để chọn cỏc chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum:
* Đặc điểm khuẩn lạc: trũn, đều, trơn búng, màu sắc trắng trong hoặc trắng sữa (tựy mụi trường nuụi cấy), mộp khuẩn lạc nhẵn, sau 5 – 6 ngày kớch thước đạt từ 0,8 – 1mm.
* Quan sỏt vi thể bằng nhuộm Gram, vi khuẩn Acetobacter xylinum bắt
màu Gram õm, nhuộm tế bào cú dạng hỡnh que đứng riờng lẻ hay xếp thành từng chuỗi.
* Kiểm tra thụng qua cỏc đặc điểm sinh húa sau: Bảng 3.3. Đặc điểm sinh húa
của chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum
TT Đặc điểm sinh hoỏ của vi
khuẩn Acetobacter xylinum Hiện tượng
Kết quả 1 - Oxy hoỏ ethanol thành axit
axetic
- Axit axetic tạo ra kết hợp với CaCO3
làm vũng sỏng rộng hơn và tạo lớp cặn đục rừ
+ 2 - Catalase - Sủi bọt khớ +
3 - Hoyer - Sinh khối khụng phỏt triển
4 - Chuyển hoỏ glycerol thành
dihydroxyaceton
- Vũng CuO xuất hiện xung quanh khuẩn lạc
+
5 - Chuyển hoỏ glucozơ thành axit - Vũng sỏng xuất hiện xung quanh
khuẩn lạc
+
6 - Kiểm tra khả năng sinh sắc tố
nõu
- Khụng thấy sắc tố nõu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7 - Kiểm tra khả năng tổng hợp
cellulose
- Vỏng vi khuẩn xuất hiện màu lam +
Qua kiểm tra hoạt tớnh catalase thấy hiện tượng sủi bọt chứng tỏ cỏc chủng đều cú hoạt tớnh dương, kiểm tra cỏc đặc tớnh sinh húa như: cú khả năng chuyển húa ethanol thành axit axetic trờn mụi trường A, B chuyển húa glucozơ thành axit axetic với sự xuất hiện của vũng phõn giải CaCO3.
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
Dựa trờn cơ sở tuyển chọn trờn thỡ cỏc chủng vi khuẩn thuộc nhúm III đều cú đặc điểm về khuẩn lạc, hỡnh dạng tế bào, cỏc đặc điểm sinh húa phự
hợp với vi khuẩn Acetobacter xylinum.
Hỡnh a
Hỡnh b
Hỡnh c
Hỡnh 3.4. Ảnh tế bào một số chủng vi khuẩn thuộc nhúm III khi nhuộm Gram
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
Qua kiểm tra tế bào bằng phương phỏp nhuộm Gram, kết quả cho thấy tất cả 6 chủng vi khuẩn thuộc nhúm III đều bắt màu hồng đỏ của fucshin, chứng tỏ 6 chủng đú đều thuộc vi khuẩn Gram õm.
Theo tỏc giả Sokolniki: độ dai chắc của màng cellulose do vi khuẩn
sinh ra cú liờn quan đến hỡnh dạng của tế bào vi khuẩn. Nếu độ dài (chiều dài
của tế bào) càng cao thỡ tớnh bền vững của màng cellulose do vi khuẩn đú tổng hợp càng lớn. Vậy theo mục đớch nghiờn cứu là chọn được chủng vi
khuẩn Acetobacter xylinum cú khả năng tạo màng dai, chắc khi quan sỏt cỏc
tế bào ở cựng độ phúng đại của vật kớnh dầu (độ phúng đại 1000 lần) kết quả
quan sỏt của chỳng tụi đó lựa chọn được chủng Acetobacter xylinum N1 đạt
được cỏc yờu cầu đặt ra.
Acetobacter xylinum là nhúm vi khuẩn duy nhất cú khả năng tổng hợp
cellulose mạnh. Do vậy, chỳng tụi tuyển chọn bằng cỏch thử khả năng tạo màng trờn mụi trường dịch thể. Kết quả tất cả 6 chủng vi khuẩn nhúm 3 đều cú khả năng tạo thành màng trờn mụi trường lỏng. Tuy nhiờn tớnh chất tạo
màng của chủng Acetobacter xylinum N1 vừa nhẵn, dai, mỏng, trắng nờn chỳng tụi bước đầu khẳng định chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 thuộc
loài vi khuẩn Acetobacter xylinum, cú khả năng cho màng cellulose mỏng, dai. Vỡ vậy, chỳng tụi lựa chọn chủng Acetobacter xylinum N1 làm đối tượng cho
cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
Đầu tiờn kiểm tra khả năng tạo màng ổn định của chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum N1 qua 3 lần liờn tiếp: từ cỏc mẫu màng dai, mỏng thu
được (do cấy khuẩn trờn của chủng Acetobacter xylinum N1 vào mụi trường
dịch thể) tiến hành phõn lập lại trờn mụi trường thạnh đĩa. Cỏc khuẩn lạc xuất hiện khỏ đồng nhất (đặc điểm, màu sắc, kớch thước của khuẩn lạc giống với
chủng Acetobacter xylinum N1 ). Từ cỏc khuẩn lạc này lại tiếp tục tiến hành (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
ngày nuụi cấy. Qua 3 lần tuyển chọn liờn tiếp đều thấy xuất hiện màng mỏng đặc điểm khuẩn lạc đồng nhất. Do vậy, cú thể khẳng định chủng vi khuẩn
Acetobacter xylinum N1 cú khả năng tạo màng ổn định.
Như vậy: Chỳng tụi đó chọn được chủng Acetobacter xylinum N1 cú
khả năng cho màng mỏng và ổn định.
3.3. Nghiờn cứu động thỏi phỏt triển của chủng Acetobacter xylinum N1 Dịch nuụi cấy chủng Acetobacter xylinum N1 sau khi li tõm, bỏ dịch,
lấy phần sinh khối, tiến hành pha loóng ở cỏc độ pha loóng khỏc nhau từ 10-1 đến 10-6. Ở mỗi độ pha loóng, đem đo giỏ trị OD ở bước súng 610nm, đồng thời ở mỗi độ pha loóng từ 10-3 đến 10-6, hỳt 100μl trang đều lờn cỏc hộp petri khỏc nhau, sau 4 ngày nuụi cấy trong tủ ấm 30oC ta đếm số khuẩn lạc. Mỗi thớ nghiệm lặp lại 3 lần. Từ kết quả đú ta cú thể lập được đồ thị tương quan giữa giỏ trị OD ở bước súng 610nm với số lượng tế bào vi sinh vật.
y = 14.428x - 0.0164R2 = 0.9981 R2 = 0.9981 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Số lượng tế bào G iỏ t rị O D 6 1 0
Hệ số tương quan, R2 = 0,9981 núi lờn mối tương quan giữa số lượng tế
bào của chủng Acetobacter xylinum N1 và giỏ trị OD tương đối chặt chẽ, do
đú cú thể sử dụng hàm số y = 14,428x – 0,0164 (hàm số y cú được khi xử lý số liệu trờn phần mềm Excel để tớnh số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy của
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên Đem nuụi cấy chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 trong cỏc điều kiện
như nhau khỏc về thời gian nuụi cấy: 0; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 16; 20; 24; 30; 36; 42; 48; 54; 60; 66; 72; 80 giờ. Sau đú lấy dịch nuụi cấy ở cỏc thời điểm khỏc nhau li tõm để thu sinh khối, bỏ dịch phớa trờn, ta bổ sung nước cất vụ trựng đỳng bằng lượng dịch đó bỏ đi rồi đem Vụntex đều. Sau đú đem đo giỏ trị OD của dịch huyền phự này để xỏc định số lượng tế bào.
Bảng 3.4. Thời gian nuụi cấy, số lượng tế bào
Thời gian 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 Số lượng tế bào x 106 3,2± 21x10-5 3,2± 2x10-4 5,7± 31x10-5 8,6± 28x10-5 15± 35x10-5 24,6± 28x10-5 48,3± 3x10-4 48,3± 21x10-5 48,17± 25x10-5 48± 21x10-5 40± 25x10-5 0 10 20 30 40 50 60 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 SL tế bào
Hỡnh 3.5. Đồ thị sinh trưởng của chủng Acetobacter xylinum N1
Dựa vào đồ thị nhận thấy:
Từ 0 đến 24h, số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy tăng nhưng chậm vỡ giai đoạn này vi khuẩn làm quen với mụi trường, đõy là pha tiềm phỏt; từ 24 đến 48h, số lượng tế bào tăng nhanh vỡ tốc độ sinh trưởng riờng cực đại, đõy là pha cấp số mũ (pha log); từ 48 đến 72h, số lượng tế bào khụng tăng do một số tế bào được sinh ra nhưng một số tế bào khỏc tương đương lại chết đi, đõy
S ố l ư ợ n g tế b ào x 1 0 6 Giờ
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên % axi t a xet ic Giờ axi t a x et ic (%)
là pha cõn bằng; từ 72h trở đi, số lượng tế bào trong dịch nuụi cấy giảm mạnh, đõy là pha suy vong.
3.4. Khảo sỏt sự thay đổi pH trong dịch nuụi cấy của chủng
Acetobacter xylinum N1
Khi nuụi cấy chủng Acetobacter xylinum N1 trong mụi trường lỏng ở
cỏc điều kiện như nhau chỉ khỏc nhau về thời gian nuụi cấy: 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48, 56, 64, 72, 80 giờ. Sau đú đem đo pH của dịch nuụi cấy bằng mỏy đo pH MP 200R và xỏc định lượng axit sinh ra theo thời gian bằng phương phỏp của Therme. Mỗi thớ nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả thu được như sau:
Bảng 3.5. Tỷ lệ pH và axit axetic trong dịch lờn men
Thời gian nuụi cấy 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 Độ pH 6,15 6,01 5,47 5,11 4,82 4,75 4,70 4,63 4,41 4,24 4,22 axit axetic(%) 2,00 ±0,2 2,10 ±0,48 2,41 ±0,2 2,60 ±0,25 2,63 ±0,21 2,74 ±0,28 2,83 ±0,19 2,86 ±0,42 2,94 ±0,32 3,01 ±0,28 3,01 ±0,31 2 2.1 2.41 2.6 2.63 2.74 2.832.86 2.94 3.01 3.01 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 axit axetic trong dịch lờn men (%)
Hỡnh 3.6. Phần trăm axit axetic trong dịch lờn men Từ kết quả bảng 3.4 và biểu hỡnh 3.6 cho thấy:
- Ở mụi trường nuụi cấy ban đầu lượng axit axetic bổ sung là 2% và đó xỏcđịnh giỏ trị pH là 6,15.
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Từ 0h đến 24h: lượng axit axetic trong dịch lờn men cú tăng, nhưng chậm, đồng thời giỏ trị pH cũng giảm. Giai đoạn này tương ứng với pha tiềm phỏt. - Từ 24h đến 72h: lượng axit axetic trong dịch lờn men tăng nhanh và giỏ trị pH giảm.
Trong quỏ trỡnh sinh trưởng vi khuẩn Acetobacter xylinum cú thể tớch lũy
được lượng axit axetic nhất định. Tuy nhiờn, khi axit axetic tăng thỡ pH giảm, nếu giỏ trị pH xuống thấp lại là một tỏc nhõn ức chế sinh trưởng của chớnh vi khuẩn này. Như vậy, chỳng tụi nhận thấy giỏ trị pH từ 4,24 đến 5,11 (tương ứng với % axit axetic là 2,60 – 2,83%) là điều kiện tốt cho sự phỏt triển của vi
khuẩn Acetobacter xylinum. Bởi vậy, chỳng tụi đó tiến hành tối ưu húa điều kiện nuụi cấy của chủng Acetobacter xylinum N1 để tỡm giỏ trị pH thớch hợp
nhất cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.5. Khảo sỏt khả năng tạo màng ở cỏc mụi trường nuụi cấy khỏc nhau Chỳng tụi sử dụng cỏc mụi trường 2, 3, 4, 5, 6 để khảo sỏt khả năng tạo
màng của chủng Acetobacter xylinum N1 rồi theo dừi thời gian tạo màng và
quan sỏt tớnh chất của màng tạo thành, cõn khối lượng khụ của màng, thử khả năng chịu lực của màng.
Bảng 3.6. Khảo sỏt khả năng tạo màng
của chủng Acetobacter xylinum N1 trờn cỏc mụi trường khỏc nhau
Chủng N1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6
Thời gian bắt đầu
tạo màng (ngày) 5 4 3 5 6
Tớnh chất màng Khỏ dai Khỏ dai Dai Dai Khỏ dai Màu sắc của
màng Màu sỏng Vàng nhạt Màu sỏng Vàng đậm Màu ngà Khối lượng khụ
của màng 3,62 3,47 3,4 4,25 3,74
Khả năng chịu
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên
Từ cỏc kết quả thớ nghiệm cho thấy mụi trường 4 là thớch hợp. Mụi trường 4 cú đầy đủ cỏc thành phần: nguồn cacbon từ đường glucozơ, nguồn nitơ hữu cơ (pepton) và vụ cơ (NH4)2SO4, nguồn vitamin từ cao nấm men, trong thành phần của cao nấm men chứa một số axit amin khụng thay thế cũng như nguồn vitamin phong phỳ đúng vai trũ là cỏc chất kớch thớch sinh
trưởng cho vi khuẩn Acetobacter xylinum. Mục đớch của chỳng tụi là tạo
màng mỏng, do vậy lựa chọn mụi trường 4 là thớch hợp.
Trờn cơ sở mụi trường 4 chỳng tụi tiến hành cỏc nghiờn cứu tiếp theo. 3.6. Tối ưu húa điều kiện nuụi cấy
Chỳng tụi đó tiến hành tối ưu húa một số điều kiện nuụi cấy như: nhiệt độ, độ pH, thời gian nuụi cấy. Trong quỏ trỡnh đú chọn một số yếu tố cố định và một số yếu tố thay đổi.
* Cỏc yếu tố cố định cỏc thành phần của mụi trường dinh dưỡng để lờn
men vi khuẩn Acetobacter xylinum (MT4), hàm lượng giống bổ sung ban đầu: chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum N1 được bổ sung vào mụi trường 4 theo
tỉ lệ 10%. Hàm lượng tế bào tương ứng trong 1ml dịch giống là: 3,2x106 tế bào/ml tương ứng với giỏ trị OD 610nm, độ pha loóng là 10-2 (theo phương phỏp pha loóng của Pasteur).
* Cỏc yếu tố thay đổi: - Nhiệt độ: X1 - pH: X2
- Thời gian nuụi cấy: X3 * Chỉ tiờu cực đại húa: (y)
a) Qua thực nghiệm nuụi cấy chỳng tụi lựa chọn khoảng cú ý nghĩa của cỏc biến số X1, X2, X3 và đưa ra khoảng biến thiờn (λ) của cỏc biến như trỡnh bày ở bảng 3.6
Khóa luận tốt nghiệp Phạm Thị Quyên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.7.Cỏc yếu tố và mức khảo sỏt ở chủng Acetobacter xylinum N1
Yếu tố khảo sỏt Cỏc mức khảo sỏt Nhiệt độ (X1, oC) pH (X2) Thời gian (X3, ngày) Mức thấp (-) 27,5 4 3 Mức cơ sở (0) 29 5,5 4,5 Mức cao (+) 30,5 7 6
Với khoảng biến thiờn λ = 1,5
b) Mụ hỡnh toỏn học mà cần thiết lập cú dạng y = bo + b11 + b22 + b33
Trong đú: y: hàm mục tiờu
1,2,3: biến mó của yếu tố nhiệt độ, pH, thời gian nuụi cấy.
c) Thiết lập ma trận theo phương phỏp “Thực nghiệm yếu tố đầy đủ”
Ma trận thực nghiệm với số yếu tố (n = 3), số thớ nghiệm tương ứng sẽ là N = 23 = 8. Kết quả thu được của thớ nghiệm được trỡnh bày dưới đõy:
Bảng 3.8. Ma trận thực nghiệm chủng Acetobacter xylinum N1
N 1 2 3 x1 x2 x3 Khối lượng màng tươi thu được Sj2
y1 y2 y3