- Chuẩn bị các tấm kính kích thước 10x20 cm, rửa sạch, sấy khô. - Silicagel G cỡ hạt 5-40µm của Viện kiểm nghiệm.
- Tráng bản sắc ký: Lấy một lượng Silicagel G cho vào cốc có mỏ (250ml) tới mức vạch khoảng 100ml. Cho thêm nước cất và khuấy để để thu được hỗn dịch lỏng sệt. Đổ hỗn dịch này lên các tấm kính đã chuẩn bị sẵn, nghiêng nhẹ để bề mặt tấm kính được tráng đều một lớp mỏng Silicagel. Để các tấm kính đã tráng lên một bề mặt sạch, bằng phẳng tránh động và bụi. Chờ tới khi bản sắc ký khô bề mặt, đem hoạt hóa ở 110ºC/1h.
- Chuẩn bị dịch chiết chấm sắc ký: Hòa tan hoàn toàn lượng cắn phân đoạn 2 (PĐ2) trong một lượng tối thiểu MeOH để làm dịch chấm sắc ký.
- Dùng mao quản lớn chấm dịch chiết PĐ 2 đã chuẩn bị ở trên lên các bản sắc ký thành dải cách mép dưới của bản mỏng 1cm.
Chloroform: Methanol = 19 :1
- Quan sát vết dưới ánh sáng tử ngoại UV254 và UV365.
- Kết quả: Trên sắc ký đồ cho 2 vết rõ và nhiều vết mờ khác nhau.
- Dùng dao sạch cạo lấy phần silicagel có 2 vết trên. Để riêng trong 2 lọ thủy tinh sạch có dán nhãn.
- Phản hấp phụ: Hòa các bột thu được trong cồn tuyệt đối, lọc bỏ silicagel qua giấy lọc thu được dịch lọc, cô cách thủy ở 50ºC đến cắn thu được hai chất tương ứng là M2 và M3.
• Kiểm tra độ tinh khiết của M2 và M3
- M2 và M3 được hòa tan bằng cồn tuyệt đối rồi kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với 3 hệ dung môi.
Hệ IV: Chloroform: Ethylacetat = 6:4
Hệ V: n-hexan: Ethylacetat: Methanol =4:4:2 Hệ VI: Chloroform: Methanol = 19:1
- Quan sát vết dưới ánh sáng tử ngoại UV254 và UV365. Ảnh chụp sắc ký đồ M2 ở 3 hệ dung môi IV, V, VI được trình bày ở hình 3.4. Ảnh chụp sắc ký đồ M3 ở 3 hệ dung môi IV, V, VI được trình bày ở hình 3.5.
- Kết quả: Ở cả 3 hệ dung môi IV, V, VI, M2 đều cho một vết. Ở hệ dung môi IV, M3 cho 4 vết.
- Nhận xét: Mẫu M2 sơ bộ tinh khiết, mẫu M3chưa tinh khiết.
• Sơ bộ nhận dạng M2
- Độ tan: M2 tan tốt trong cồn tuyệt đối, methanol; không tan trong nước. - Định tính M2 bằng các phản ứng hóa học:
+ Phản ứng Cyanidin: Hòa tan cắn M2 với 2 ml cồn tuyệt đối trong ống
nghiệm sạch, thêm một ít bột Magie kim loại và 5 giọt HCl đặc, lắc đều và đun nóng cách thủy không thấy xuất hiện màu đỏ đậm (+).
cồn tuyệt đối trong ống nghiệm sạch, thêm vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện tủa vàng, thêm 1ml nước cất thấy tủa tan và màu vàng của dung dịch trong ống nghiệm tăng lên (+).
+ Phản ứng với dd FeCl3 5%: Hòa tan cắn M2 với 1 ml cồn tuyệt đối trong
ống nghiệm sạch, thêm vào 1-2 giọt FeCl3 5% thấy xuất hiện tủa màu xanh đen (+).
Kết luận: M2 có thể là một flavonoid.
• Quy trình phân lập các chất ở phân đoạn n-hexan hạt Cần tây được tóm
tắt ở sơ đồ hình 3.6
Hình 3.6: Tóm tắt quy trình phân lập chất từ phân đoạn n-hexan hạt Cần tây
Kết luận: Từ phân đoạn dịch chiết n-hexan hạt Cần tây, bằng phương pháp sắc ký cột hấp phụ và phương pháp sắc ký bản mỏng chế hóa đã phân lập được 3 chất là M1, M2, M3. Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng cho thấy M1 và M2 tương đối tinh khiết, M3 chưa tinh khiết. Sơ bộ nhận dạng M1
có thể là flavonoid có công thức phân tử là C19H18O13 hoặc C26H14O8. M2 có
thể là một flavonoid.
Phân đoạn n-hexan
Sắc ký cột hấp phụ
Phân đoạn có chứa tinh thể M1
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3
Tinh chế M1
M2
Sắc ký chế hóa
Hình 3.4: Ảnh chụp sắc ký đồ của M2 với 3 hệ dung môi
IV: Sắc ký đồ với hệ dung môi IV V: Sắc ký đồ với hệ dung môi V
VI: Sắc ký đồ với hệ dung môi VI
Hình 3.5: Ảnh chụp sắc ký đồ của M3 với hệ IV IV V VI UV254 UV254 UV365
