Mẫu cây Bảy lá một hoa tươi thu hái ở Đà Lạt, Lâm Đồng, vào tháng 12 năm 2013. Sau khi nghiên cứu về thực vật, phần dưới mặt đất của Bảy lá một hoa được rửa sạch, thái mỏng, sấy đến khối lượng không đổi ở 55oC. Bảo quản trong túi nilon để sử dụng trong quá trình nghiên cứu.
Hình 2.1: Phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa sau khi sơ chế 2.1.2. Hoá chất, trang thiết bị
Hoá chất
- Cồn 960, nước cất hai lần, dung môi n-hexan, ethyl acetat, methanol, cloroform, aceton, dicloromethan.
- Các dung môi hóa chất dùng trong phân tích đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV.
- Bột silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck), bột silica gel pha đảo YCM (30 - 50 µm, FuJi Silisa Chemical Ltd.)
- SKLM được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (Merck) (silica gel, 0.25 mm) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (Merck, 0.25 mm).
- Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol hơ nóng.
- Các dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm: cột sắc ký, bình cầu, bình nón, ống đong, ống nghiệm,…
- Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI). - Tủ sấy Memmert, Binder-FD115.
- Bếp điện, bếp đun cách thủy.
- Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR. - Đèn UV- Vilber lourmat, máy chụp ảnh UV.
- Máy scan CanoScan LiDe 100. - Máy siêu âm Power sonic 405.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).
- Phổ tử ngoại được ghi trên máy UV-VIS Cary Khoa phân tích - Viện Dược liệu.
- [α]D đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter
- Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) được đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, VKH&CNVN.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được đo trên máy Bruker AM500 FT- NMR của Viện Hoá học, VKH&CNVN.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật
Mẫu tiêu bản tươi (có đủ tiêu chuẩn để định loại bao gồm cơ quan sinh sản (hoa), và cơ quan sinh dưỡng (cành non, lá) cùng các thông tin ghi chép tại thực địa) thu hái tại Trung tâm cây thuốc Đà Lạt – Lâm Đồng – Viện dược liệu (ký hiệu: P8) được gửi sang Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam để giám định tên khoa học.
2.2.2. Nghiên cứu về hoá học 2.2.2.1. Phƣơng pháp định tính.
Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học [2], [3].
2.2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết và phân lập chất tinh khiết từ Bảy lá một hoa.
+ Chiết cao tổng:
Phương pháp chiết nóng: sử dụng cồn 80o
ở 70o C.
Phương pháp chiết lỏng – lỏng: với các dung môi có độ phân cực tăng dần sử dụng để chiết phân đoạn.
+ Phương pháp phân lập và tinh chế chất tinh khiết:
Sử dụng các phương pháp: SKLM, SKC, rửa, kết tinh để phân lập chất sau đó ứng dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc.
Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định dựa trên các thông số vật lý như điểm nóng chảy, độ tan,... và các phương pháp phổ bao gồm: phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân.
Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu chiết xuất và phân lập chất tinh khiết từ phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa
Chiết 3 lần bằng EtOH 800 thu hồi dung môi
Cao tổng Bổ sung nước
Lắc với EtOAc Cao nước
Cao EtOAc
Chạy cột, tinh chế
Chất tinh khiết
Lắc với n-hexan Cao n-hexan
Dịch nước Lắc với diclomethan Cao diclomethan Dịch nước Bảy lá một hoa (phần dưới mặt đất)
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu thực vật
Mẫu thực vật được thu hái vào tháng 12/ 2013 tại Trung tâm cây thuốc Đà Lạt – Viện dược liệu. Quan sát thấy các đặc điểm sau (Hình 3.1):
Cây thảo, mọc thẳng đứng, cao khoảng 120 cm; thân rễ gần hình trụ ngắn, màu nâu đỏ, đường kính khoảng 2 - 3 cm, có những ngấn ngang; thân trên mặt đất màu xanh, mọc thẳng đứng, đơn độc không phân nhánh. Lá có màu lục, cuống dài 3 cm, phiến lá mỏng, mép nguyên, xếp thành 1 vòng 6 lá trên thân, cách gốc khoảng 40 cm, 5 gân chính, xuất phát từ gốc, chóp nhọn, gốc hình nêm. Hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, to, đều, cuống hoa dài 80 cm, thẳng đứng. Đài 6, dạng lá, rời nhau, hình mũi giáo, kích thước 8×2,5 cm, màu lục. Cánh hoa 6, màu vàng, dạng dải, kích thước 4,5 0,1 cm, bằng nhau. Nhị nhiều, dài 2 cm. Bầu thượng, hình trứng, màu tím đỏ.
Qua nghiên cứu đặc điểm thực vật cây Bảy lá một hoa, đối chiếu với các tài liệu chuyên khoa phân loại thực vật như: ―Thực vật chí Việt Nam‖ [6], ―Thực vật chí Trung Quốc‖,.... với sự giúp đỡ của PGS. TS. Vũ Xuân Phương cùng các chuyên gia thực vật, chúng tôi giám định mẫu cây Bảy lá một hoa thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng có tên khoa học là Paris chinensis Franch. (Phụ lục 1) họ Trọng lâu (Trilliaceae).
Hình 3.1: Mẫu cây BLMH thu hái ở Đà Lạt – Lâm Đồng Lá và hoa Cuống hoa và Hoa
Tràng, nhị, nhuỵ
3.2. Kết quả định tính
- Mục đích: Khảo sát sơ bộ các nhóm chất hóa học có trong thân rễ Bảy lá một hoa.
- Tiến hành: Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học [2], [3].
3.2.1. Định tính saponin
+ Thiết kế thí nghiệm: cho vào ống nghiệm to 2 g bột dược liệu, thêm vào 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt trong 15 phút.
+ Hiện tượng: có nhiều bọt xuất hiện bền vững.
Kết luận: Dược liệu có chứa nhiều saponin
3.2.2. Định tính alcaloid
+ Thiết kế thí nghiệm: Lấy 0,5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 15 ml dung dịch H2SO4 1N. Đun sôi, để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N đến pH 9 - 10. Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5 ml. Dịch chiết cloroform được gộp lại và lắc với H2SO4 1N. Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 ml rồi thêm vào từng ống 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau: Ống 1: TT Mayer; Ống 2: TT Dragendorff; Ống 3: TT Bouchardat
+ Hiện tượng:
Ống 1: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng nhạt. Ống 2: Dung dịch trong suốt, không có tủa vàng cam. Ống 3: Dung dịch trong suốt, không có tủa nâu.
3.2.3. Định tính glycosid tim
+ Thiết kế thí nghiệm: cho 5 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 100 ml cồn 25% rồi ngâm trong 24 h. Gạn lấy dịch chiết vào cốc có mỏ dung tích 100 ml. Thêm vào dịch chiết 3 ml chì acetat 30% khuấy đều. Lọc qua giấy lọc gấp nếp vào cốc cỏ mỏ dung tích 100 ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm khoảng 1ml chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại và tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào bình gạn. Lắc kỹ 2 lần với CHCl3: MeOH (4: 1) mỗi lần 8 ml. Gạn dịch chiết CHCl3 vào cốc cỏ mỏ, loại nước bằng Na2SO4 khan. Chia đều dịch chiết vào 3 ống nghiệm nhỏ đã được sấy khô và bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Cắn thu được đem tiến hành các phản ứng sau:
Phản ứng Liebermann-Burchardt: cho vào ống nghiệm chứa cắn 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 450, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Hiện tượng: Ở giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ tím.
Phản ứng Legal: hòa tan cắn trong ống nghiệm bằng 0,5 ml ethanol 900. Nhỏ 1 giọt thuốc thử natri nitroprussinat 0,5% và hai giọt dung dịch NaOH 10%.
Hiện tượng: Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
- Phản ứng Baljet: cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5 ml ethanol 90%. Lắc đều cho tan hết cắn.
Hiện tượng: Khi nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, không thấy xuất hiện màu đỏ cam.
Chuẩn bị dịch chiết cồn: cân 20 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100 ml. Thêm 50 ml cồn 800, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính flavonoid và coumarin sau:
3.2.4. Định tính flavonoid
- Phản ứng cyanidin: cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại. Nhỏ từng giọt HCl đặc (3 - 5 giọt).
Hiện tượng: Để yên một vài phút, dung dịch không chuyển từ màu vàng sang màu đỏ.
- Phản ứng với kiềm: Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên miệng lọ amoniac đặc. Không thấy màu vàng hiện rõ.
- Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vào 2 - 3 giọt dd FeCl3. Không có tủa màu xanh đen .
Kết luận: Dƣợc liệu không có flavonoid.
3.2.5. Định tính coumarin
Phản ứng mở và đóng vòng lacton:
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn, ống 1 thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên.
Đun cả 2 ống nghiệm cách thủy đến sôi, để nguội. Quan sát thấy ống 1 có màu tủa đục màu nâu, ống 2 trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều. Quan sát thấy tủa ống 2 tan, dung dịch trong, ống 1 không có hiện tượng gì; acid hóa ống 1 bằng vài giọt HCl đặc, ống 1 nhạt màu hơn, cả hai ống dung dịch trong suốt.
Quan sát hiện tượng huỳnh quang:
Nhỏ 2 - 3 giọt dịch chiết cồn lên một khoang giấy thấm. Nhỏ 2 - 3 giọt dung dịch NaOH 5% lên vị trí có dịch chiết, sấy nhẹ. Che 1 phần diện tích
dịch chiết trên giấy lọc bằng 1 miếng kim loại, rồi chiếu tia tử ngoại trong 1 vài phút. Bỏ miếng kim loại ra, quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại thấy cả 2 phần đều phát quang giống nhau.
Kết luận : Dƣợc liệu không có coumarin.
Chuẩn bị dịch chiết nƣớc: cân 20 g bột thân rễ Bảy lá một hoa cho vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml nước cất, đun sôi cách thủy 10 phút, lọc nóng. Dùng dịch lọc làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu cơ, acid amin, polysaccarid, đường khử như sau:
3.2.6. Định tính tanin
Thiết bị thí nghiệm: Cho vào 4 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết nước, làm các phản ứng sau:
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: cho vào ống nghiệm 2 - 3 giọt dd FeCl3 5%.
Hiện tượng: không có tủa màu xanh đen.
Phản ứng với dung dịch gelatin 1%: thêm 2 - 3 giọt dung dịch gelatin 1% vào ống nghiệm chứa dịch chiết
Hiện tượng: Không xuất hiện tủa bông vàng.
Phản ứng với chì acetat: cho vào ống nghiệm dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt dung dịch chì acetat 10%.
Hiện tượng: Không thấy có tủa bông trắng.
Phản ứng với đồng acetat: cho vào ống nghiệm chứa dịch chiết Bảy lá một hoa 2-3 giọt đồng acetat.
Hiện tượng: Không xuất hiện tủa nâu.
Kết luận: Dƣợc liệu không có tanin. 3.2.7. Định tính acid hữu cơ
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào ống nghiệm có dịch chiết nước Bảy lá một hoa một ít tinh thể Na2CO3.
Hiện tượng: Không có bọt khí bay ra.
Kết luận: Dƣợc liệu không có acid hữu cơ. 3.2.8. Định tính acid amin
Thiết kế thí nghiệm: Lấy 2 ml dịch chiết Bảy lá một hoa vào ống nghiệm sạch, thêm vào 2 - 3 ml giọt thuốc thử ninhydrin 3%, đun cách thủy sôi 10 phút quan sát hiện tượng.
Hiện tượng: Sau khi đun cách thuỷ thấy dung dịch chuyển sang màu tím.
Kết luận: Dƣợc liệu có acid amin 3.2.9. Định tính đƣờng khử:
Thiết kế thí nghiệm: Lấy 2 ml dịch chiết nước Bảy lá một hoa, thêm vào 3 giọt thuốc thử Fehling A và Fehling B, đun cách thủy 10 phút và quan sát hiện tượng
Hiện tượng: Sau khi đun cách thuỷ thấy có tủa đỏ gạch.
Kết luận: Dƣợc liệu có đƣờng khử. 3.2.10. Định tính polysaccharid
Thiết kế thí nghiệm: Cho vào ống 1: 4 ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol, ống 2: 4 ml dịch chiết BLMH và 5 giọt thuốc thử Lugol không thấy xuất hiện màu nâu đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu không có polysaccharid.
Chuẩn bị dịch chiết ether dầu hoả: cân 10 g bột dược liệu cho vào bình nón 100 ml; đổ ngập ete dầu hoả, ngâm qua đêm; lọc thu dịch lọc. Dịch lọc dùng để làm các phản ứng định tính chất béo và sterol.
3.2.11. Định tính chất béo
Nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hoả lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hơi hết dung môi thấy không để lại vết mờ trên giấy lọc.
3.2.12. Định tính sterol
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi dung môi đến khô. Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ. Để nghiêng ống nghiệm 450 nhỏ từ từ dung dịch H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm. Kết quả cho thấy giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện một vòng tím đỏ.
Kết luận: Dƣợc liệu có sterol. 3.2.13. Định tính caroten
Cho vào 2 ống nghiệm dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi cách thuỷ đến cắn, thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy xuất hiện màu xanh.
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong phần dƣới mặt đất của Bảy lá một hoa bằng phản ứng hóa học.
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận 1 Saponin Phản ứng tạo bọt ++ Có 2 Alcaloid Phản ứng với TT Mayer - Không Phản ứng với TT Dragendorff - Phản ứng với TT Bouchardat - 3 Glycosid tim Phản ứng Liebermann- Burchardat + Không Phản ứng Legal - Phản ứng Baljet - 4 Flavonoid Phản ứng Cyanidin - Không Phản ứng với kiềm - Phản ứng với FeCl3 5% - 5 Coumarin Phản ứng đóng mở vòng lacton - Không
Hiện tượng huỳnh quang -
6 Tanin Phản ứng với FeCl3 5% - Không Không Phản ứng với gelatin 1% - Phản ứng với chì acetat 10% - Phản ứng với đồng acetat -
7 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không 8 Đường khử Phản ứng với TT Fehling ++ Có 9 Acid amin Phản ứng với Ninhydrin 3% ++ Có 10 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol - Không 11 Sterol Phản ứng Liebermann-
Burchardat + Có
12 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không
13 Caroten Phản ứng với H2SO4 đặc - Không
Hình 3.2: Hình ảnh kết quả định tính acid amin, saponin và đƣờng khử
Nhận xét : Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng cho thấy phần dưới mặt đất BLMH có chứa saponin, acid amin, đường khử, sterol, không chứa alcaloid, glycosid tim, flavonoid, coumarin, tanin, acid hữu cơ, polysaccharid, chất béo, caroten.
3.3. Kết quả chiết xuất và phân lập và nhận dạng các chất
3.3.1. Quy trình chiết các phân đoạn từ phần dƣới mặt đất Bảy lá một hoa
Thân rễ Bảy lá một hoa rửa sạch, thái lát mỏng, phơi khô, cân 1,2 kg, sau đó chiết ba lần bằng cồn 80o
ở 70oC, gộp các dịch chiết, loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 450 g cao tổng (chiếm 37,5%). Hoà cao tổng trong 1 lít nước cất và chiết lỏng – lỏng 3 lần với các dung môi có độ phân cực tăng dần:
n-hexan, diclomethan và ethyl acetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao phân đoạn tương ứng: cao phân đoạn EtOAc (m = 31,04 g, chiếm 2,6%), cao phân đoạn nước (m = 398,12 g, chiếm 33,2%).
Sau khi chiết các cao phân đoạn, nhận thấy hai phân đoạn n-hexan và diclomethan khối lượng cao không đáng kể, qua tìm hiểu tài liệu cũng không