trung về phía đầu vùng ITS1. Số nucleotid khác nhau dao động từ 1-3 nucleotid.
Thực hiện so sánh từng cặp bằng công cụ BLAST, chúng ta thu được hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa các mẫu. Kết quả hệ số tương đồng này được thể hiện ở bảng 3.3 dưới đây :
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng
ZA1 ZA2 ZA3 ZA4 ZA5
ZA1
ZA2 99,8
ZA3 99,7 99,6
ZA4 99,7 99,6 99,7
ZA5 99,5 99,3 99,5 99,7
Nhận xét: Hệ số tương đồng giữa 5 trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3-99,8 %.
Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng
truổng với 2 trình tự của chi Zanthoxylum được công bố trên ngân hàng gen thế giới
Trình tự đoạn ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng sau khi đã xác định, được đem so sánh với 2 trình tự ITS- rADN đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới. Đó là: trình tự ITS- rADN của Zanthoxylum avicennae (kí hiệu ZAK) (mã số HM851487) và Zanthoxylum schinifolium (kí hiệu ZSK) (mã số JN226786). Kết quả so sánh nhờ sử dụng công cụ BLAST thể
hiện bằng hệ số tương đồng được thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu ZA1-ZA5 và mẫu ZAK, ZSK
ZAK 99,8 99,8 99,7 99,7 99,4
ZSK 96,9 96,7 96,9 96,9 96,6
Nhận xét: Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu ZA1-ZA5 với mẫu ZAK dao động từ 99,4-99,8%. Trong khi đó hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu ZA1-ZA5 với mẫu ZSK thấp hơn, dao động từ 96,6-96,9%.
Kết quả cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng
Sau khi xác định được trình tự nucleotid vùng ITS-rADN tiến hành dựng cây phân loại bằng phần mềm ClustalX2. Kết quả thể hiện ở hình 3.9
Hình 3.9.
Cây phân loại 5 mẫu Muồng truổng dựa trên so sánh trình tự ITS-rADN
Ghi chú: Tỉ lệ % lặp lại từ 100 phép thử độc lập (hệ số bootstrap) được thể hiện ở các nhánh
Nhận xét: Cây phân loại cho thấy trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng được chia thành 3 nhóm riêng biệt như sau:
Nhóm 1 gồm trình tự vùng ITS-rADN của 2 mẫu ZA4 và ZA5 (có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN là 99,7%). Có hệ số bootstrap là 87.
Nhóm 2 gồm trình tự vùng ITS-rADN của 2 mẫu ZA1 và ZA2 (có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN là 99,8%). Có hệ số bootstrap là 77.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN của loài Muồng truổng
Để khuếch đại đoạn ITS-rADN từ sản phẩm ADN tổng số chiết tách được, đề tài đã sử dụng cặp mồi ITS4 – ITS5, cặp mồi được sử dụng phổ biến trên thế giới trong nghiên cứu phân tử liên quan đến trình tự ITS-rADN (universal primers). Kết quả phản ứng PCR cho thấy sản phẩm thu được có kích thước gần 750 bp (Hình 3.2), tức là tương đương với kích thước đoạn ITS-rADN thường gặp (650 – 750 bp) của nhiều loài thực vật hạt kín. Ví dụ: đậu Lens sp. (650 bp)…[44]
Để thuận lợi cho phản ứng phân tích trình tự và nhằm bảo quản nguồn gen dùng cho các mục đích nghiên cứu sau này, sản phẩm PCR được đưa vào vector tái tổ hợp và tiến hành chọn dòng plasmid mang đoạn gen mục tiêu. Vector tách dòng được lựa chọn là plasmid pCR2.1. Plasmid pCR2.1 có gen kháng ampicillin nên E.coli có chứa vector này phát triển được trong
môi trường có ampicillin. Mặt khác, vector pCR2.1 có gen lac-Z mã hóa cho enzym - galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh. Trong trường hợp đoạn gen ITS-
rADN được tích hợp vào vector pCR2.1 thì gen lac-Z không được biểu hiện nên không chuyển hóa X-gal thành màu xanh. Do vậy, trong môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin và X-gal,
những khuẩn lạc màu xanh là khuẩn lạc E.coli có plasmid pCR2.1 không tích hợp gen ITS- rADN còn những khuẩn lạc màu trắng là những khuẩn lạc E.coli có khả năng chứa plasmid
pCR2.1 đã tích hợp gen ITS-rADN. Tuy nhiên không phải tất cả các khuẩn lạc trắng đều mang gen ITS-rADN mà chúng có thể là những khuẩn lạc mang gen LacZ mất khả năng tổng hợp enzym -galactosidase chuyển hóa X-gal thành hợp chất có màu xanh. Mặc dù vậy việc lựa chọn các khuẩn lạc trắng để tiến hành tách chiết plasmid cũng đã loại bỏ được phần lớn các trường hợp không mong muốn. Tiếp tục lựa chọn dựa vào đặc điểm vector pCR2.1 đã được tích hợp gen ITS-rADN có kích thước và trọng lượng lớn hơn nên di chuyển chậm hơn trong điện trường so với vector pCR2.1 không được tích hợp gen ITS-rADN. Những nguyên tắc lựa chọn dòng plasmid tái tổ hợp nêu trên đã được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu sinh học phân tử ở trong và ngoài nước [4], [34].
Với nguyên tắc trên, chúng tôi đã lựa chọn được dòng E.coli mang plasmid tái tổ hợp ở
khuẩn lạc trắng tương ứng với các đường chạy số 1, 3, 4, 5, 7, 8, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 (Hình 3.3 và 3.4). Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn dòng vi khuẩn này mang đoạn gen mục tiêu (gen ITS-rADN), plasmid từ dòng tế bào đã chọn được tách ra và cắt kiểm tra bằng enzym giới hạn EcoRI. Kết quả phản ứng cắt bằng enzym giới hạn được thể hiện ở hình 3.5,
theo đó, plasmid tái tổ hợp đã tách ra một đoạn ADN có kích thước tương đương kích thước sản phẩm PCR ban đầu (gần 750bp). Như vậy có thể khẳng định đã biến nạp thành công plasmid mang gen ITS-rADN vào dòng tế bào E.coli tương ứng. Dòng tế bào E.coli này được nuôi cấy
nhằm cung cấp nguồn gen ITS-rADN chuẩn bị cho phản ứng xác định trình tự ADN và cũng là nguồn dự trữ plasmid mang đoạn gen mục tiêu để bảo quản lâu dài.
4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam
Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng. Kích thước vùng ITS (729-730 bp) và tỉ lệ thành phần (G+C) (64,33-64,66%) thu được tương tự như kích thước và tỉ lệ thành phần (G+C) vùng ITS của nhiều loài thực vật hạt kín đã được công bố. Trong đó kích thước và tỉ lệ thành phần (G+C) của 2 mẫu ZA1, ZA2 (64,66%) lớn hơn ở các mẫu ZA3, ZA4, ZA5 (64,33-64,61%). Việc xác định trình tự và sử dụng trình tự nucleotid đoạn ITS-rADN để so sánh nhằm tìm ra mối quan hệ tiến hóa giữa các loài hoặc sự đa dạng di truyền của các cá thể trong cùng một loài đã được sử dụng phổ biến từ lâu trên thế giới. Theo một nghiên cứu quan hệ tiến hóa của 8 mẫu Mimulus guttatus (cây hoa Khỉ) thu hái tại Mỹ C E Ritland, K Ritland và N A Straus thu được mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN của 8 mẫu Mimulus guttatus dao động từ 99,2-100% [18]. Một nghiên cứu khác cho kết quả mức độ
tương đồng của 15 mẫu Zanthoxylum schinifolium thu hái từ các vùng khác nhau (ecotypes) ở Hàn Quốc dao động từ 99-100% [37].
Trong nghiên cứu này, 5 mẫu Muồng truổng thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam (ZA1-ZA5) có mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3- 99,8%, kết quả này thể hiện sự gần gũi về mặt di truyền của 5 mẫu. Tiếp tục tiến hành so sánh trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng ZA1-ZA5 với trình tự vùng ITS-rADN của mẫu Muồng truổng thu hái tại Hàn Quốc (ZAK, mã số trên ngân hàng gen HM851487) cho thấy gần như không có nhiều thay đổi, mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa ZAK và 5 mẫu ZA1- ZA5 dao động từ 99,4-99,8%. Như vậy không chỉ 5 mẫu Muồng truổng thu hái ở Việt Nam (ZA1-ZA5) có mức độ tương đồng trình tự ITS-rADN cao mà mẫu ZAK cũng cho kết quả tương tự.
Từ những kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy mức độ tương đồng của trình tự vùng ITS-rADN ở mỗi loài khác nhau là rất khác nhau. Trong phạm vi loài Muồng truổng dù các mẫu nghiên cứu được thu hái ở cùng một vùng hay ở các vùng, các quốc gia khác nhau thì mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN đều khá cao. Qua đây có thể thấy rằng sử dụng trình tự vùng ITS-rADN không phản ánh rõ sự đa dạng di truyền giữa các quần thể Muồng truổng ở các vùng khác nhau. Tuy nhiên từ phép so sánh gióng hàng được thể hiện trên hình 3.8 có thể thấy sự khác nhau của các nucleotid vùng ITS-rADN ở 5 mẫu ZA1-ZA5 hầu hết tập trung về phía vùng ITS1. Điều này gợi ý cho việc tập trung vào nghiên cứu vùng ITS1 của ADN ribosom (thay vì toàn bộ vùng ITS) trong những nghiên cứu tiến hóa, chọn tạo giống, đánh giá đa dạng di truyền trên quy mô lớn hơn… đối với loài Muồng truổng.
Sử dụng công cụ BLAST cùng với nguồn cơ sở dữ liệu phong phú từ ngân hàng gen thế giới chúng tôi tiến hành tìm kiếm trình tự nucleotid có mức độ tương đồng cao nhất với trình tự ITS-rADN của mẫu ZA1 (đại diện cho 5 mẫu ZA1-ZA5). Kết quả cho thấy, ngoài trình tự của mẫu Muồng truổng ở Hàn Quốc (ZAK), một trình tự có mức độ tương đồng cao là trình tự vùng ITS-rADN của loài Zanthoxylum schinifolium (kí hiệu ZSK, mã số trên Genbank là JN226786). Thực hiện so sánh trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Muồng truổng ZA1-ZA5 với trình tự ITS- rADN của mẫu ZSK. Kết quả cho thấy mức độ tương đồng di truyền đã thay đổi đáng kể, dao động từ 96,6-96,9% (Bảng 3.4). Sự thay đổi này phản ánh quan hệ tiến hóa đã chuyển từ quan hệ gần gũi trong cùng loài lên quan hệ tiến hóa xa hơn giữa các loài trong cùng chi. Đây là 1 ví dụ minh chứng cho vai trò của trình tự ITS-rADN trong việc phân loại mối quan hệ tiến hóa giữa các bậc phân loại khác nhau.
Để có thể khai thác và phát triển nguồn dược liệu từ Muồng truổng ở Việt Nam một cách có hiệu quả hơn nữa song song với đánh giá đa dạng di truyền cần tiến hành thực hiện những nghiên cứu đánh giá tác dụng sinh học, tách chiết các chất có hoạt tính dược học từ cây Muồng truổng. Trên cơ sở đó khi kết hợp với các kết quả về đa dạng gen vùng ITS chúng ta có thể chọn tạo được giống có năng suất cao và chất lượng tốt nhằm phát triển và tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu Muồng truổng trong tương lai.
KẾT LUẬN
Đã xác định được trình tự nucleotid vùng phiên mã nội của ADN ribosom của 5 mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam. Đã so sánh được trình tự nucleotid vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Muồng truổng với nhau, và
Zanthoxylum được công bố trên ngân hàng gen thế giới. Kết quả cho thấy mức độ tương đồng trình tự gen vùng ITS trong loài Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) DC.) là tương đối cao, phản ánh sự đa dạng thấp trình tự gen ADN ITS trong loài Muồng truổng. Cụ thể như sau:
Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,3-99,8% giữa 5 mẫu Muồng truổng thu hái tại các vùng khác nhau ở Việt Nam.
Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 99,4-99,8% giữa 5 mẫu Muồng truổng thu hái tại Việt Nam với mẫu Muồng truổng thu hái tại Hàn Quốc.
Mức độ tương đồng trình tự vùng ITS-rADN dao động từ 96,6-96,9% giữa 5 mẫu Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lam.) với mẫu Zanthoxylum schinifolium thu hái tại Hàn Quốc.
ĐỀ XUẤT
Tiếp tục triển khai nghiên cứu tác dụng sinh học kết hợp nghiên cứu hóa học nhằm chọn tạo giống Muồng truổng cho năng suất cao, chất lượng tốt để phát triển hơn nữa những ứng dụng nguồn thảo dược Muồng truổng.
Tiếp tục tiến hành nghiên cứu sử dụng marker phân tử vùng ITS1 của ADN ribosom để đánh giá đa dạng di truyền loài Muồng truổng trên quy mô lớn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bộ môn Thực vật (2005), Thực vật học, Trường đại học Dược Hà Nội.
Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Thành phố Hồ Chí Minh.
Cục quản lý dược (2012), Đề án “Quy hoạch tổng thể phát triển dược liệu giai đoạn từ nay
đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030”, Bộ Y Tế.
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học Phân tử, NXB Giáo Dục, Hà Nội.
Lê Văn Hạc, Trương Thị Thu, Trần Đình Thắng, Nguyễn Xuân Dũng (2005), “Tách và xác định cấu trúc của một số hợp chất từ rễ cây Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae (Lamk.) DC) ở Hà Tĩnh”, Hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần
thứ IV.
Đặng Ngọc Hoa (2011), Bước đầu nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các quần thể loài
cây thuốc sa nhân tím (Amomum longiligulare T. L. Wu) ở Việt Nam bằng chỉ thị RAPD- PCR, Đại học KHTN – ĐHQG Hà Nội.
Hoàng Thị Hòa (2005), Sử dụng một số hệ IZOZYM để nghiên cứu đa dạng di truyền ở một
số loài cây dược liệu bản địa ở Việt Nam, Đại học KHTN – ĐHQG Hà Nội.
Hoàng Văn Lâm, Trần Văn Ơn (2008), “Tính đa dạng sinh học của cây trong chi
Gynostemhi ma Blume. ở tỉnh Cao Bằng”, Tạp chí thông tin Y Dược học,6/2008, tr. 36-40. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa (2004), Sử dụng chỉ thị RAPD
và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây lim xanh (Erythropheleum fordii Oliv.), Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2004, 23/9/2004, tr.
464-468.
Đỗ Tất Lợi (1995), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội.
Nguyễn Hoàn Nghĩa và cộng sự (2007), “ Kết quả phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD”, Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 14/2007, tr. 44-48.
Lê Duy Thành (2007), Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử RAPD - PCR
và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở Việt Nam Orthosiphon stamineus Benth, Đề tài NCKH QG.04.28, Đại học KHTN-ĐHQG Hà Nội.
Khuất Hữu Thanh (2006), Kĩ thuật gen - Nguyên lý và ứng dụng, NXB Khoa học và Kĩ
thuật, Hà Nội.
Tiếng Anh
Altukhov, Yuri Petrovich (2003), Intraspecific Genetic Diversity, PTC
Academkniga, Russia.
Alvarez I, Wendel J.F (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29(3), pp. 417– 434.
Baldwin B.G, Sanderson M.J, Porter J.M, Wojciechowski M.F, Campbell C.S, DonoghueM.J (1995), “The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny”, Ann. Missouri Bot. Gard, 82(2),
pp. 247 – 277.
Baldwin BG (1992), “Phylogenetic utility of the internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA in plants: an example from the compositae”, Mol Phylogenet Evol, 1(1), pp. 3-16.
C E Ritland, K Ritland and N A Straus (1993), “Variation in the ribosomal internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) among eight taxa of the Mimulus guttatus species complex.”, Mol Biol Evol, 10 (6), pp. 1273-1288.
Chen S et al (2010), “Validation of the ITS2 Region as a Novel DNA Barcode for Identifying Medicinal Plant Species”, PLos one, 5(1), pp.e8613.
Dapeng Bai, J. Brandle, R. Reeleder (1997), “Genetic diversity in North American ginseng (Panax quinquefolius L.) grown in Ontario detected by RAPD analysis”,
Genome , 40(1), pp. 111-115.
Dung TD, Chang HC, Chen CY, Peng WH, Tsai CH, Tsai FJ, Kuo WW, Chen LM, Huang CY (2011), “Zanthoxylum avicennae extracts induce cell apoptosis through protein phosphatase 2A activation in HA22T human hepatocellular carcinoma cells and block tumor growth in xenografted nude mice”, Int J Mol Med, 28(6), pp. 927-36.
F.M. El-Domyati, Rania A.A. Younis, S. Edris, A. Mansour, J. Sabi and A. Bahieldin (2011), “Molecular markers associated with genetic diversity of some medicinal plants in Sinai”, Journal of Medicinal Plants Research, 5(10), pp.
1918–1929.
Ghadaa B, Olfaa S (2008), “Sequence analysis of the internal transcribed spacers (ITSs) region of the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) in fig cultivars (Ficus carica L.)”, Scientia Horticulturae, 120(1), pp. 34 – 40.
Helmut Ripperger, Trinh Thi Thuy, Andrea Porzel, Tran Van Sung and Guenter Adam (1999), Bishordebibyl terpene alkaloids from Zanthoxylum avicennae,