20 Đối chứng 1A Đỗ tương Học viện Nông Nghiệp - -
21 Đối chứng 1 B Đỗ tương Học viện Nông Nghiệp - -
22
Đối chứng
Dương Đỗ tương Học viện Nông Nghiệp
+ +
23 Nước - -
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 69
Hình 3.17 PCR phát hiện KuMV trên cây họđậu bằng cặp mồi KuAFor và KuARev. Các giếng: (1) VNP 1061 ; (2) VNP1062 ; (3) VNP1063; (4) VNP1064; (5) VNP1065; (6) VNP1066; (7) VNP1067; (8) VNP1068; (10) VNP1070; (11) VNP1071; (13) VNP1072; (14) VNP1073; M: thang DNA 1 kb, (15) VNP1074; (16) VNP1075; (18) VNP1076; (19) VNP1077; (20) VNP1078; (21) VNP1079; (22) VNP1080; (23) Đối chứng 1A; (24) Đối chứng 1B; (25) Đối chứng dương; (26) Nước; ( Hình --> chỉ băng )
Hình 3.18 PCR phát hiện KuMV trên cây họđậu bằng cặp mồi KuBFor và KuBRev. Các giếng: (1) VNP 1061 ; (2) VNP1062 ; (3) VNP1063; (4) VNP1064; (5) VNP1065; (6) VNP1066; (7) VNP1067; (8) VNP1068; (10) VNP1070; (11) VNP1071; (13) VNP1073; (14) VNP1073; M: thang DNA 1 kb, (15) VNP1074; (16) VNP1075; (18) VNP1076; (19) VNP1077; (20) VNP1078; (21) VNP1079; (22) VNP1080; (23) Đối chứng 1A; (24) Đối chứng 1B; (25) Đối chứng dương; (26) Nước; ( Hình --> chỉ băng )
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 70
Hình 3.19. PCR phát hiện KuMV trên cây đậu tương tại khu vực Hà Nội năm 2014.
3.4. Phát hiện KuMV và MYMV bằng LAM-PCR
LAMP-PCR là kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt mới được phát triển gần
đây. Do có nhiều ưu điểm như độ nhạy cao (gấp 100 lần so với PCR thông thường), tính đặc hiệu cao (do sử dụng ít nhất 4 mồi khác nhau) và không cần dùng máy PCR nên kỹ thuật này đã được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực chẩn
đoán (Mori & Notomi, 2009; Sidoti et al., 2013). Kỹ thuật đã được áp dụng để
chẩn đoán nhiều tác nhân gây bệnh cây, kể cả begomovirus (Almasi et al., 2013; Fukuta et al., 2003; Kuan et al., 2010).
Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm phát hiện KuMV và MYMV dùng 2 bộ mồi LAMP-PCR thiết kế cho mỗi virus. Bộ mồi LAMP- PCR phát hiện KuMV và MYMV được thiết kế lần lượt trên vùng gen mã hóa protein Rep và CP của 2 virus này.
Sáu mẫu đậu đỗđã được chọn từ các mẫu đã kiểm tra PCR để kiểm tra khả
năng phát hiện 2 virus KuMV và MYMV bằng kỹ thuật LAMP-PCR dùng 2 bộ
mồi vừa thiết kế. Kết quả kiểm tra LAMP-PCR (Bảng 3.17, Hình .20) cho thấy: + Phản ứng LAMP-PCR với bộ mồi đã phát hiện MYMV đã cho phản
ứng dương tính đối với cả 3 mẫu đậu đỗ nhiễm MYMV và có phản ứng âm tính với tất cả 3 mẫu nhiễm KuMV cũng như đối chứng nước. Kết quả này cho thấy bộ mồi LAMP-PCR đối với với MYMV rất đặc hiệu và có thể ứng dụng trong chẩn đoán.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71
+ Trái lại, phản ứng LAMP-PCR với bộ mồi phát hiện KuMV đã cho phản ứng dương tính với tất cả 6 mẫu thử nghiệm kể cả đối chứng nước. Chúng tôi đã lặp lại thí nghiệm với mồi được pha mới. Tuy nhiên kết quả
không thay đổi. Hiện tượng phản ứng dương giả của kỹ thuật LAMP-PCR đã
được quan sát thấy ở nhiều phòng thí nhiệm trên thế giới, chủ yếu do nguồn vật liệu của phản ứng (mồi, enzyme, hóa chất) bị nhiễm trong quá trình chuẩn bị. Ngoài ra, khả năng tự mồi hóa cũng là nguyên nhân tạo phản ứng dương giả. Việc thay thế vật liệu cũng như thiết kế lại mồi đòi hỏi thời gian và kinh phí nên chúng tôi đã không thể cải thiện được tính đặc hiệu của phản ứng LAMP-PCR phát hiện KuMV.
Bảng 3.17. Đánh giá khả năng phát hiện KuMV và MYMV bằng LAMP-PCR
TT Mẫu PCR LAM-PCR
MYMV KuMV MYMV KuMV
1 M5 + - + + 2 M19 + + + + 3 M21 + - + + 4 M10 - + - + 5 M13 - - - + 6 M23 - - - + 7 H2O - +
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
1. Đã điều tra bệnh virus đậu đỗ tại Hà Nội năm 2014 trên một loạt các cây họ đậu nhưđậu tương, đậu xanh, đậu đen, đậu đũa. Trên đậu tương, bệnh virus biểu hiện 3 triệu chứng, phổ biến nhất là triệu chứng khảm nhăn. Trên
đậu xanh, bệnh virus biểu hiện 3 triệu chứng, tuy nhiêm cả 3 triệu chứng đều phổ biến. Trên đậu đen, bệnh virus biểu hiện 3 triệu chứng, phổ biến nhất là triệu chứng khảm nhăn. Trên đậu cove triệu chứng khảm nhăn và khảm vàng lá xuất hiện nhiều trong quá trình điều tra.
2. Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh virus trên cây đậu tương, đậu
đen, đậu xanh, đậu cove năm 2014 – 2015 cho thấy tỉ lệ bệnh virus địa bàn Hà Nội chỉ giao động từ 2% - 10%. Tỉ lệ bệnh cao nhất phát hiện ở Thạch Bàn, Cổ Bi – Gia Lâm chủ yếu ở giai đoạn cây đang ra hoa và quả.
3. Đã sử dụng 15 kít ELISA thương mại do Viện DSMZ (Đức) cung cấp để phát hiện virus từ 55 mẫu cây họ đậu biểu hiện triệu chứng nhiễm virus thu tại Miền Bắc Việt Nam. Phản ứng ELISA dương đã được quan sat thấy đối với 10 virus bao gồm BCMNV (38.2%), PSbMV (21.8%), BBWV-2 (18.2%), SMV (16.4%), BYMV (14.5%), BCMV (12.7%), CPSMV (14.5%), BBTMV (|3.6%), PEMV (32.7%), CABMV (3.6%), SBMV (3.6%). Ngoài trừ
BCMV có giá trị OD cao đáng kể so với ngưỡng thì 9 virus còn lại có giá trị
OD cao hơn không nhiều so với ngưỡng.
4. Kết quả kiểm tra PCR dùng cặp mồi chung cho thấy có 3/5 (60%) mẫu thử có phản ứng dương tính chứng tỏ nhiễm legumovirus. Các mẫu dương tính là mẫu đậu tương và đậu đen.
5. Kiểm tra PCR bằng cặp mồi đặc hiệu KuMV và MYMV trên 19 mẫu
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 73
3 đẫu xanh và 2 đậu tương và 5/19 ( 26.3%) mẫu đậu tương nhiễm KuMV. Như
vậy, đây là lần đầu tiên MYMV đã được phát hiện thấy tại Miền Bắc.
6. Thử nghiệm phản ứng LAMP-PCR đối với 2 virus KuMV và MYMV cho thây bộ mồi phát hiện MYMV rất đặc hiệu, có thểứng dụng trong chẩn đoán.
2. Kiến Nghị
Do điều kiện nghiên cứu còn hạn chế và thời gian làm thí nghiệm có hạn chúng tôi chưa có điều kiện đi sâu và đề nghị tiếp tục nghiên cứu một số vấn đề sau:
- Xác định được đầy đủ thành phần loài virus hại trên cây đậu đỗở miền Bắc Việt Nam.
- Tiếp tục có những nghiên cứu sâu hơn về đặc trưng sinh học của KuMV, sự phân bố của KuMV, MYMV ở các vùng khác nhau tại Việt Nam.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt.
Hà Viết Cường (2010), Virus thực vật, phytoplasma và viroid, Trường ĐH NN Hà Nội.
Hà Viết Cường (2010), Phát hiện và đặc trưng phân tử Kudzu mosai virus gây bệnh khảm vàng đậu tương ở miền Bắc.
Trần Văn Điền ( 2007), Giáo trình cây đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. Hà Thị Hiến (2004), Đậu tương đậu xanh và kỹ thuật trồng, NXB Văn hóa dân tộc. Vũ Triệu Mân ( 2007), Giáo trình bệnh cây chuyên khoa, NXB Nông Nghiệp. Lê Lương Tề (1998), Giáo trình bệnh cây Nông Nghiệp, NXB Nông Nghiệp.
Tài liệu tiếng anh
CABI (2012), Bean common mosaic virus, http://www.cabi.org/cpc/ datasheet/9424 CABI (2012), Soybean mosaic virus, http://www.cabi.org/cpc/datasheet/48750 CABI (2012), Mungbean yellow mosaic virus, http://www.cabi.org/cpc/datasheet/32725
Almasi, M. A., Ojaghkandi, M. A., Hemmatabadi, A., Hamidi, F. & Aghaei, S. (2013). Development of Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of the Tomato Yellow Leaf Curl Virus. J Plant Pathol Microbiol 4, 153.
Chen, P. Y., Choi, C. W., Rao, G. P., Khurana, S. M. P. & Lenardon, S. L. (2008). Soybean mosaic virus. Characterization, diagnosis & management of plant viruses Volume 1: industrial crops, 389-422.
Copeland, R. (1998). Assaying levels of plant virus by ELISA. Methods Mol Biol 81: 455-460. French, R. (2010). BeanCommonMosaicVirus ( BCMV).
Fukuta, S., Kato, S., Yoshida, K., Mizukami, Y., Ishida, A., Ueda, J., Kanbe, M. & Ishimoto, Y. (2003). Detection of tomato yellow leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification reaction. Journal of virological methods 112: 35-40.
Mukeshimana (2003). Bean common mosaic virus (BCMV) and bean common mosaic necrosis virus (BCMNV) are seed-borne viruses of dry and snap beans.
Ha, C., Coombs, S., Revill, P., Harding, R., Vu, M. & Dale, J. (2008a). Molecular characterization of begomoviruses and DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminiviruses were present in the Old World prior to continental separation. Journal of general virology 89: 312-326.
Ha, C., Revill, P., Harding, R. M., Vu, M. & Dale, J. L. (2008b). Identification and sequence analysis of potyviruses infecting crops in Vietnam. Archives of virology 153: 45-60.
Hà Viết Cường (2010). Phát hiện và đặc trưng phân tử Kudzu mosaic virus trên cây đậu tương ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí BVTV 5: 11-17.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 75 Hampton, R. O. (1975). The nature of bean yield reduction by bean yellow and bean
common mosaic virus. Phytopathology 65: 1342-1346.
Hao, N. B., Albrechtsen, S. E. & Nicolaisen, M. (2003). Detection and identification of the blackeye cowpea mosaic strain of Bean common mosaic virus in seeds of Vigna unguiculata sspp. from North Vietnam, Australasian Plant Pathology 32: 505-509. Hart, L. P. & Saettler, A. (1981). Bean Common Mosaic Virus: Cooperative Extension
Service, Michigan State University.
Iqbal, A., Khalil, I. A., Ateeq, N. & Khan, M. S. (2006). Nutritional quality of important food legumes. Food Chemistry 97: 331-335.
Irwin, M. E. & Schultz, G. A. (1981). Soybean mosaic virus. Plant Protection Bulletin, FAO, 29: 41-55.
Koehler, H., CHANG, C. I. H., SCHEIER, G. & Burke, D. (1987). Nutrient Composition, Protein Quality, and Sensory Properties of Thirty-Six Cultivars of Dry Beans (Phaseolus vulgaris L.). Journal of Food Science 52: 1335-1340.
Koenig, R. (1981). Indirect ELISA Methods for the Broad Specificity Detection of Plant Viruses. Journal of General Virology, 55:53-62.
Koenig, R. & Paul, H. L. (1982). Variants of ELISA in plant virus diagnosis. J Virol Methods 5: 113-125.
Kuan, C.-P., Wu, M.-T., Lu, Y.-L. & Huang, H.-C. (2010). Rapid detection of squash leaf curl virus by loop-mediated isothermal amplification. Journal of virological methods 169: 61-65.
Larsen, R. C., Miklas, P. N., Druffel, K. L. & Wyatt, S. D. (2005). NL-3 K strain is a stable and naturally occurring interspecific recombinant derived from Bean common mosaic necrosis virus and Bean common mosaic virus. Phytopathology 95: 1037-1042. Mayo, M. & d’Arcy, C. (1999). Family Luteoviridae: a reclassification of luteoviruses. The
Luteoviridae, 15-22.
Mink, G. & Silbernagel, M. (1992). Serological and biological relationships among viruses in the bean common mosaic virus subgroup: Springer.
Moradi, A., Nasiri, J., Abdollahi, H. & Almasi, M. Development and evaluation of a loop- mediated isothermal amplification assay for detection of Erwinia amylovora based on chromosomal DNA. European Journal of Plant Pathology 133: 609-620.
Morales, F. J. & Bos, L. (1988). Bean common mosaic virus. AAB descriptions of plant viruses, 6.
Mori, Y. & Notomi, T. (2009). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of infection and chemotherapy 15: 62-69.
Muhammad, I. (2010). Legume-infecting Begomoviruses Diversity And Host Interaction: Quaid-i-Azam University, Islamabad.
Musavi, M., Shahraeen, N., Azizi, A. & Salari, N. (2014). Serological and molecular properties of isolates of Bean common mosaic virus-BCMV from Khorasan Razavi province. Archives of Phytopathology and Plant Protection 47: 830-841.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 76 Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K., Amino, N. & Hase, T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic acids research 28: e63-e63.
Revill, P. A., Ha, C. V., Lines, R. E., Bell, K. E., Vu, M. T. & Dale, J. L. (2004). PCR and ELISA-based virus surveys of banana, papaya and cucurbit crops in Vietnam. Asia Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology 12: 27 - 32.
Rubino, L., Russo, M., De Stradis, A. & Martelli, G. P. (2012). Tepovirus, a novel genus in the family Betaflexiviridae. Archives of virology 157, 1629-1633.
Sanfaçon, H., Iwanami, T., Karasev, A., Van der Vlugt, R., Wellink, J., Wetzel, T. & Yoshikawa, N. (2011). Family secoviridae. In Virus taxonomy, pp. 881-900: Elsevier.
Shanmugasundaram, S. & Britain, G. (2004). Improving Income and Nutrition by Incorporating Mungbean in Cereal Fallows in the Indo-Gangetic Plains of South Asia: DFID Mungbean Project for 2002-2004: Proceedings of the Final Workshop and Planning Meeting: AVRDC, The World Vegetable Center.
Sidoti, F., Bergallo, M., Costa, C. & Cavallo, R. (2013). Alternative molecular tests for virological diagnosis. Molecular biotechnology 53: 352-362.
Song, J.-Y., An, G.-H. & Kim, C.-J. (2003). Color, texture, nutrient contents, and sensory values of vegetable soybeans [Glycine max (L.) Merrill] as affected by blanching. Food Chemistry 83: 69-74.
Sugawara, K., Himeno, M., Keima, T., Kitazawa, Y., Maejima, K., Oshima, K. & Namba, S. Rapid and reliable detection of phytoplasma by loop-mediated isothermal amplification targeting a housekeeping gene. Journal of General Plant Pathology 78: 389-397.
Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H. & Notomi, T. (2008). Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products. Nature protocols 3: 877-882.
Tsai, W., Shih, S., Rauf, A., Safitri, R., Hidayati, N., Huyen, B. & Kenyon, L. (2013). Genetic diversity of legume yellow mosaic begomoviruses in Indonesia and Vietnam. Annals of Applied Biology 163: 367-377.
Van der Poel, A. (1990). Effect of processing on antinutritional factors and protein nutritional value of dry beans (Phaseolus vulgaris L.). A review. Animal feed science and technology 29: 179-208.
Vetten, H., Lesemann, D.-E. & Maiss, E. (1992). Serotype A and B strains of bean common mosaic virus are two distinct potyviruses: Springer.
Wei, Q.-W., Yu, C., Zhang, S.-Y., Yang, C.-Y., Miriam, K., Zhang, W.-N., Dou, D.-L. & Tao, X.-R. (2012). One-step detection of Bean pod mottle virus in soybean seeds by the reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification. Virology journal 9, 187. Zhang, J. & Wu, Z. J (2013) First Report of Kudzu mosaic virus on Pueraria montana
(Kudzu) in China. Plant Disease 97:148-148.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 77 http://donabio.com.vn/CNSH/tabid/86/isd_news_news/143/Default.aspx - Theo trang
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 78
PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Kiểm tra phát hiện các potyvirus trên đậu đỗ thu tại Miền Bắc Việt Nam năm 2014 bằng phương pháp ELiSA
ST
T mã Mẫu Cây Triệu chứng Giai đoạn Vị trí
Nguồn gốc Tỉnh BCMN V BCM V BYM V BBWV- 2 pSbM V SMV
1 VNP7 Đỗ xanh Khảm,biến dạng Ra hoa FAVRI I Hà Nội 0.101 0.129 0.147 0.161 - -
2 VNP19 Đỗ xanh Khảm,biến dạng Ra hoa Hậu Lộc I Thanh Hoa 0.111 - - - 0.219 0.137
3 VNP50 Sắn dây Khảm vàng lá Ra hoa Lục Yên I Yên Bái - - - - 0.238 -
4 VNP66 Sắn dây Lục Yên I Yên Bái 0.105 0.126 - 0.17 - 0.139
5 VNP67 Sắn dây Lục Yên I Bắc Giang 0.104 - - - -
- 6
VNP111.
2 Đỗ xanh Khảm, biến dạng Ra hoa Nghi Kim-Nghi Lộc I Nghệ An 0.106 - 0.158 - -
-
7 VNP129 Đỗ xanh Khảm, biến dạng Ra hoa Đan Phượng-Hà Nội I Hà Nội 0.112 - - - 0.262
-
8 VNP144 Đỗ xanh Khảm, biến dạng Ra hoa Gia Lâm-Hà Nội I Hà Nội - - - - -
-
9 VNP145 Đỗ xanh Ra hoa Gia Lâm-Hà Nội I Hà Nội - - - - 0.221
- 10 VNP147
Đỗ
tương Khảm, biến dạng Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội 0.103 0.219 - - -
- 11 VNP148
Đỗ
tương Khảm, biến dạng Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - - -
- 12 VNP149
Đỗ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 79
13 VNP150
Đỗ
tương Khảm, biến dạng Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội 0.136 - - - 0.236 0.164
14 VNP151
Đỗ
tương Khảm vàng lá Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - - -
- 15 VNP152
Đỗ
tương Khảm vàng, biến dạng Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - - -
- 16 VNP153
Đỗ
tương Khảm vàng lá Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - - 0.263
- 17 VNP154
Đỗ
tương Khảm vàng lá Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - 0.262 -
- 18 VNP155
Đỗ
tương Khảm vàng lá Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - 0.179 -
- 19 VNP156
Đỗ
tương Khảm xoăn lá Ra hoa Gia Lâm I Hà Nội - - - 0.18 -
-